成人EB病毒相关T/NK细胞淋巴组织增殖性疾病临床及实验特征张倩1张红宇*1张文丽1钟凤鸾1冯佳1孟庆祥1尹为华2聂李平3北京大学深圳医院1血液内科,2病理科,3检验科,广东深圳,518036摘要:目的:分析成人EB病毒相关的T/NK细胞淋巴组织增殖性疾病(EBV+T/NK-LPD)的临床及实验室检查特征,探讨成人EBV+T/NK-LPD早期诊断和临床预后。方法:对2005年至2012年间于我院诊断的19例EBV+T/NK-LPD临床病理资料进行回顾性分析。结果:男11例,女8例,中位年龄32岁;起病至确诊时间平均3.5个月,中位生存时间为2.5个月。持续不明原因发热、肝脾大、肝功能损害、间质性肺炎为常见首发表现。血细胞减少出现在18例患者中,所有患者具有β2-MG、LDH、TNF、IL-6升高、血EBV-DNA阳性(中位拷贝数>106)。骨髓细胞形态表现为异常大颗粒淋巴细胞、组织细胞增多或伴噬血现象,骨髓流式细胞检查易见CD5、CD7缺失的T/NK淋巴细胞;骨髓活检病理检查10例患者可见异常淋巴细胞间质浸润,6例可见少量大细胞成灶性浸润,免疫组化异常细胞表达为CD3+CD56+NK细胞2例,CD3+CD8+T细胞11例,CD3+CD4+细胞3例。全部病例表达细胞胞质内抗原(TIA-1)和EBER。3例淋巴结活检病理主要为反应性增生。全部患者死于进行性的多器官功能不全。结论:成人EBV+T/NK-LPD以发热和肝脾大为主要临床表现,实验室检查以外周血EBV-DNA持续升高,EB病毒感染T/NK淋巴细胞组织浸润,并有多器官进行性损伤的炎症反应综合征,临床多预后不良,上述特征性临床表现及实验室检查有助于成人EBV+T/NK-LPD的及时诊断。关键词:EB病毒;淋巴组织增殖性疾病;T淋巴细胞;成人;临床特征;免疫表型*通信作者:张红宇,主任医师. 电话:(0755)83923333-6125.E-mail: zyiqu@yahoo.com.cnClinical features and laboratory findings of adult Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative diseaseZHANG Qian1,ZHANG Hong-Yu1*,ZHANG Wen-Li1,ZHONG Feng-Luan1,FENG Jia1,MENG Qing-Xiang1,YIN Wei-Hua2,NIE Li-Ping31Department of Hematology,2Department of Pathology,3Department of Laboratory,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036,Guangdong Province,China*Corresponding Author: ZHANG Hong-Yu,Senior Physician. Tel:(0755)83923333-6125. E-mail:zyiqu@yahoo.com.cnAbstract:ObjectiveTo summarize the clinical featuresand laboratory findings of Adult Epstein-Barr virus associated T/NK cell lymphoproliferative disease(EBV+T/NK-LPD).MethodsThe clinical datas of 19 adult patients withEBV+T/NK-LPD were retrospectively analyzed .ResultsThere were 11 males and 8 females. The median age was 32 years. The average duration from onset of symptoms to diagnosis was 3.5 months. The median survival time was 2.5 months. Unkown fever, hepatosplenomegaly, liver dysfunction and interstitial pneumonia were the main clinical features. High levels of β2-MG、LDH、TNF、IL-6,and significant increased EBV-DNA level(median level >106copies/ml) were exhibited in all the patients . Cytopenia were seen in 18 cases. Morphologically, atypical large granular lymphocytes and hemophagocytosis were common in bone marrow smears . Loss of CD5 or CD7 expression were frequently observed in T/NK lymphocytes by flow cytometry of bone marrow cells. bone marrow biopsy showed atypical lymphocytes interstitial infiltrated in 10 cases, while a few large cells infiltrated in 6. Immunohistochemistry showed the infiltrated lymphocytes were CD3+CD56+ in 2 cases,CD3+CD8+ in 11 cases and CD3+CD4+ in 3 cases . TIA-1 and EBER were positive in all biopsy specimens. 3 cases underwent biopsy oflymphonodes[L1]showed reactive proliferations of lymphocytes . All the patients died of multiorgan failure.Conclusions: The study reveals that fever, hepatosplenomegaly were the most common clinical features of adult EBV+T/NK-LPD, the bone marrow infiltration of EBV-infected T/NK lymphocytes and significant increased level of EBV-DNA were observed in all cases. Given its poor clinical outcome, these clinical and experimental features can serve as a reliable marker for the timely diagnosis of adult EBV+T/NK-LPD.Key words: Epstein-Barr virus ; Lymphoproliferative disease; T-lymphocytes; Adult; Clinical features; ImmunophenotypingEB病毒相关的T/NK淋巴组织增殖性疾病(Epstein-Barr virus associated lymphoproliferative disease ,EBV+T/NK-LPD)主要在儿童发病,成人病例极为少见。但随着近年对该疾病的进一步认识,成年病例也逐渐增多,其临床表现也具有显著异质性,且预后极差,例如T/NK细胞型的慢性活动性EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection, CAEBV)、蚊虫叮咬过敏或种痘样水疱病、EBV相关的噬血性淋巴组织细胞增多症(EBV-HLH)等,既可以呈慢性惰性病程,也可呈明显侵袭性。尽管2008年WHO淋巴及造血组织肿瘤分类中规范了儿童系统性EBV+T/NK-LPD及种痘样水疱病的组织学诊断,但EBV+T/NK-LPD的组织学改变缺乏相对客观的病理特征,病理表现跨越了多形性到单形性改变[1],早期诊断极为困难。而对于那些尚未进展至肿瘤样组织学改变的部分病人,其诊断更需依赖于临床及实验室检查。我们回顾性分析了我院在2005年-2012年间收治的19例成人EBV+T/NK-LPD,结合文献对其临床和生化特征、骨髓细胞形态、骨髓活检病理及免疫组化、外周血淋巴细胞的免疫学表型及治疗结果进行总结分析,探讨EBV+T/NK-LPD的早期快速诊断方法,减少误诊、漏诊,争取更多的治疗时间。资料与方法一般资料2005年1月-2012年12月间我院诊治的EBV+T/NK-LPD患者19例(获得性免疫缺陷或接受免疫抑制剂治疗的患者以及有明确T/NK细胞淋巴瘤/白血病病理学改变者除外)。所有患者符合CAEBV [2]或EBV-HLH[3]诊断;诊断标准符合2008年美国NIH的EB病毒淋巴增殖性疾病国际分类会议的建议[4]。本组病例包括年龄≥18岁,严重疾病病程(如高烧、肝脾肿大等)超过3个月,血清中EBV-DNA负荷(拷贝数≥102。5copies/ml)升高,有主要器官受累及的组织学证据及受感染组织中EBV+T/NK细胞数量增多。检查所有患者于我院初次就诊至开始治疗前完成相关检查。包括常规体查,鼻咽部、胸腹部CT检查及腹部B超;血液指标:血常规(WBC、HGB、PLT计数)、肝功能(ALT、GGT、BIL、ALB)、乳酸脱氢酶(LDH)、凝血功能(PT、APTT、FIB、TT)、血沉(ESR),血尿β2微球蛋白(β2-MG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)、EBV-DNA PCR检测;骨髓检查:骨髓细胞形态学和骨髓活检病理及免疫组织化学,并完善了外周血和骨髓细胞的流式细胞仪免疫分型检查,采用CD2、CD3、胞浆CD79a、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD23、CD25、CD56、CD64、FMC7、TdT、sIg的淋巴细胞单克隆抗体(COLTER,美国)进行分析。对有皮疹、肝炎、腹泻等表现的患者,以及经上述检查未确诊的患者进行了皮肤、肝脏及消化道粘膜活检病理检查,活检标本经10%甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋制片,HE染色。免疫组织化学染色单克隆抗体包括CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CD16、CD19、CD10、CD56、TIA、granzyme B等,所有骨髓活检病理均完善了EBV编码的小RNA(EBER)原位杂交(FISH)的检测。治疗在明确诊断以前所有发热的患者均接受了抗生素治疗,其中10例接受了抗病毒治疗(干扰素和利巴韦林),均对治疗无反应。3例仅表现肌炎和肝炎的患者(CAEBV)接受了小剂量强的松治疗(30mg/d),临床表现为进行性高热和噬血细胞综合征的患者均接受了化疗,其中8例患者采用了CHOP+L-asp(CTX 750mg/m2 d1,ADM 50mg/m2 d1, VCR 1.4mg/m2 2mg max d1, PDN 100mg d1-5, L-asp 1万U d3、5、7、9、11、13)、6例接受EPOCH(CTX 750mg/m2 d1, ADM 50mg/m2 d1, VCR 1.4mg/m2 2mg max d1, PDN 100mg d1-5, VP16 0.1 d3-5),2例接受了HLH94/2004(Dex 10 mg/m2 daily, week 1-2,5 mg/m2 daily week 3-4,2.5 mg/m2 daily, week 5-6,1.25 mg/m2 daily, week 7. VP-16 150 mg/m2 twice weekly (week 1-2),once weekly (week 3-8). Cyclosporin A 3mg/kg q12h (血药浓度谷值约200mg/L) week 1-8(HLH94方案从第9周开始)等方案化疗。随访及统计学分析全组病例进行随访至2012年12月,以总生存期(OS)作为观察终点。采用SPSS16.0进行统计学分析。非正态分布的计量资料用中位数表示,单因素分析采用Fisher确切概率法。结果一般[L2]情况及临床特征(见图1)19例患者中男11例,女8例,年龄20-70岁,中位年龄32岁,病程2天至28月。临床类型为CAEBV的6例,EBV-HLH的13例。在所有患者中发热为初次就诊时的主要表现(16/19)。有肝脾肿大的患者12例,其中B超提示有门脉增宽(>10mm)9例,浅表淋巴结肿大患者仅有3例,未发现有鼻咽部、韦氏环累及的患者。其它器官累及表现为肝炎(9/19)、间质性肺炎(15/19,有肺部CT的影像学表现)、浆膜腔积液(6/19),仅有2例在疾病过程中有皮肤损害,表现为溃疡结痂,患者自起病到确诊平均时间为3.5个月。Figure 1.Clinical presentations at the time of diagnosis实验室检查特征(见表1)血常规:仅1例患者初次就诊时无血细胞减少。白细胞减少10例,中位WBC 1.9×109/L(0.1-3.8);仅1例患者白细胞升高;HGB<10g/L 12例,中位HGB 62g/L(50-94);血小板减少16例,中位PLT 42×109/L(4-90)。初始表现全血细胞减少的9例,均为EBV-HLH患者。凝血功能:出现凝血功能异常的患者9例,全部见于EBV-HLH患者,主要表现为低纤维蛋白原血症,无出血表现。8例早期死亡病例在疾病进展过程中均出现了凝血功能紊乱。生化及免疫学检查:9例患者出现不同程度肝功能损害,表现为谷丙转氨酶和转肽酶升高。12例患者出现低蛋白血症;6例EBV-HLH病例表现有严重黄疸和低蛋白血症。高LDH、β-2MG、TNF-α、IL-6出现在所有的患者中。β-2MG显著升高(>3.5umol/L)6例。EB病毒感染的检查:所有患者外周血清EBV-DNA阳性,初次就诊时均超过104拷贝/ml(中位数5.2×106拷贝/ml)。5例完善血清EBV抗体检查,均为EA-IgG>320,但EBNA为阴性。骨髓病理活检标本及肝脏、皮肤、消化道粘膜活检标本中EBER检测均为阳性,以大细胞为主,CD3和TIA-1抗原阳性分布一致。骨髓形态:初次就诊时骨髓细胞形态检查异常的患者占73.7%(14/19),主要表现为异常淋巴细胞(大颗粒淋巴细胞)增多(占有核细胞比例5.5到8.5%)、组织细胞增多伴噬血现象,涂抹细胞增多。异常淋巴细胞形态表现为核染色质粗,较松,核形多不规则或有瘤状突起,核仁大而明显,胞浆深蓝可见空泡,有吞噬现象。初次骨髓检查未提示明显异常的5例患者进行了二次骨髓检查,均表现为异常大颗粒淋巴细胞增多等上述细胞形态。初始表现为单一白血病细胞形态的病例未包括在本病例中,但有3例病人在疾病进展过程中出现了大颗粒淋巴细胞白血病的骨髓细胞形态表现。流式细胞学检查:所有患者外周血淋巴细胞亚群,6例CAEBV病例中,3例为CD3+CD8+(细胞毒T细胞)比例超过70%,2例为CD16+CD56+(NK细胞型)比例超过50%,1例为CD3+CD4+比例超过50%。13例EBV-HLH患者中10例为CD3+CD8+细胞型,1例为NK细胞型,2例为CD3+CD4+细胞型。13例EBV-HLH进行了骨髓淋巴细胞的流式细胞仪表型分析,免疫表型与外周血一致,但抗原表达缺失常见。其中8例EBV-HLH患者有CD5缺失的抗原表达异常,其中4例伴有CD7缺失,1例提示为CD16+CD56+CD38+。病理检查:(见表2)所有患者在初诊时均完成了骨髓组织病理检查:其中10例患者可见异常淋巴细胞间质浸润,6例可见少量大细胞成灶性浸润,但病理形态难于确认为肿瘤性生长,进一步免疫组化分析提示异常细胞分别为CD3+CD56+NK细胞2例,CD3+CD8+T细胞11例,CD3+CD4+T细胞3例;3例淋巴结活检病理为反应性增生。2例患者经皮肤活检(CD3+CD8+T细胞型1例,CD3+CD56+NK细胞型1例),肝脏活检确诊的1例(CD3+CD8+T细胞型)患者同时进行了消化道粘膜活检(CD3+CD8+T细胞型),均与流式细胞仪分析一致。所有病理标本中EBER检测均为阳性。Table 1.Laboratory findings at the time of diagnosisLaboratory findingsPatient ratioCAEBV EBV-HLHWBC<4*10^9/L1/69/13Hb<100g/L2/610/13BPC<100*10^9/L4/612/13ALT>40U/L3/66/13AST>40U/L2/66/13TBIL>19umol/L1/66/13TNF-α> N6/613/13IL-6> N6/613/13APTT>45sec0/67/13FIB<2g/L0/66/13LDH>240 U/L6/613/13ALB<35g/L4/68/13β2-MG6/613/13ALT: alanine aminotransferase. AST: aspartate aminotransferase. TBIL: total bilirubin. PT: prothrombin time. APTT: activated partial thromboplasin time. FIB: fibrinogen. ALB: albumin. LDH: lactate dehydrogenase. TNF-α: tumor necrosis factor-α. IL-6: interleukin-6. N: normal.β2-MG:β2-microglobulinTable 2. Numbers of Immunohistochemistry findings in different sitesPhenotypeClinical categoryBiopsy siteCAEBVEBV-HLHBMSkinLiverGICD4+T123///CD8+T31011111NK(CD3-CD56+)2121//BM: bone marrow.GI: Gastrointestinal mucosa疗效8例EBV-HLH患者尽管接受化疗但仍在1月内进展死亡,其中1周内死亡4例。死亡原因包括急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、消化道出血和不可逆的凝血功能障碍,均为原发病无法控制的多器官功能衰竭所致。2例患者接受免疫化疗(HLH-94方案)原发病得到控制,并分别进行了自体及异基因造血干细胞移植,但在移植后1年和2月后复发死亡,2例患者在病程中进展为淋巴瘤(皮肤T/NK细胞淋巴瘤和侵袭性NK细胞白血病),分别在初次就诊2年后及1月后出现。所有患者在治疗及随访过程中均死亡,最长生存时间28个月,中位生存时间2.5个月。不同检查指标对生存时间影响的分析我们分析了生存时间不足1月的高危因素,单因素包括EBV-DNA、LDH、β2-MG、TNF-α、IL-6、FIB、ALB水平。发现高β-2MG(>3.5umol/L)和低白血症(<26g/L)为早期死亡的不良预后因素(P=0.000和P=0.002)。讨论EB病毒(EBV)在正常人群中感染率在90%以上,大多表现为婴幼儿时期的无症状性感染,在青少年多为自限性的感染性单核细胞增多症,极少数可转为慢性活动性的EBV感染(CAEBV)[5]。EBV+T/NK-LPD通常具有CAEBV背景,部分可进展为EBV相关的淋巴瘤[6]。EBV+T/NK-LPD早期虽有感染性疾病特征,但大多呈多系统损害,临床表现多样,可呈急性或亚急性,其预后已非感染性疾病性质。成人EBV+T/NK-LPD发病极少,且预后极差,其在疾病早期呈多系统临床表现,缺乏明确的病理组织形态学,极易误诊而延误治疗。本组病例自就诊到确诊的平均时间为3.5个月,多数患者已进展至器官功能不全,因此与本病相关的临床与实验特征分析在早期诊断中尤为重要。2008年EB病毒(EBV)淋巴增殖性疾病国际分类会议制定了EBV+T/NK-LPD的诊断标准草案,包括严重疾病病程(如高热、肝脾肿大等)超过3个月,血清EBV抗体滴度增高抗CVA-IgG>5120;抗EA-IgG≥640,或抗EBNA<2,和(或)EBV-DNA负荷(拷贝数)升高,有主要器官受累及的组织学证据,如间质性肺炎、骨髓造血细胞减少、色素膜炎、淋巴结炎、持续性肝炎或脾大,受感染组织中EBV+T/NK细胞数量增多(EBER+/LMPl+)[2]。病理诊断采纳了Ohshima[1]等基于病理和分子[L3]生物学方面的资料提出的EBV+T/NK-LPD的建议分类标准,其组织可呈多形性到单形性的分级变化,但目前该病理分类在临床使用的意义未完全确定[7]。由于缺乏典型的病理特征,诊断标准更强调患者的临床与实验检查证据。我们观察到19例患者初诊时多伴有不明原因的发热、肝脾大、肝功能损害、血细胞减少等临床特征,而淋巴结、肝脏和皮肤活检病理形态主要为反应性增生,无明确肿瘤性生长证据;但所有患者EB病毒感染状态明确,包括血清EBV-DNA拷贝升高和组织内EBER阳性的淋巴细胞浸润,与现有的文献报道一致[8、9]。Kimura H.等报道的82例患者表现中以发热(92.7%)、肝脏肿大(79.3%)、脾脏肿大(73.2%)、肝功能异常(67.1%)、血小板减少症(45.1%)和贫血(43.9%)常见[9]。尽管上述临床特征无特异性,但当除外其它多系统疾病后,血清EBV-DNA和组织EBER的检测对EBV-LPD有明确的诊断意义,因而可作为早期的诊断指标。本组病例的骨髓细胞形态均有特征性的变化,表现为异常大颗粒淋巴细胞增多、组织细胞增多或伴有噬血现象。骨髓病理常见有异形淋巴细胞的间质浸润和灶状浸润,当结合免疫组化发现这些细胞主要为活化的T/NK细胞(TIA-1和GramB表达),并与EBER阳性细胞的分布一致。此外T细胞抗原表达缺失也是本病实验特征,其中CD5和CD7表达缺失最常见。上述病理特征尽管没有包括在现有的诊断标准内,但能较好地反映这一疾病的性质,因而也可作为疾病的诊断指标。由于多数患者表现为肝脾肿大而没有浅表淋巴结肿大,骨髓检查较其它器官的活检具有更高的可行性,因此综合骨髓形态、流式细胞学及骨髓病理检查可能对EBV+T/NK-LPD的早期诊断更有意义。LPD是一种系统性的炎症性疾病,由于活化的T/NK淋巴细胞持续分泌如TNF-α,Fas-L, IL-8, IL-6等炎症细胞因子[10、11],造成相应增殖组织和器官的炎症性损伤,故初始表现为全身性疾病,其中最常见的累及部位是肝和脾,其次是淋巴结、骨髓、皮肤及肺等,我们检测到所有患者的炎症细胞因子浓度(TNF-α、IL-6)均显著升高,与文献报道相符,持续的炎症反应可导致器官不可逆的损伤,本组治疗结果也显示即使接受化疗也未改变多数患者的预后,本组病例多因素分析也发现患者血清的高β2-MG水平为早期死亡的不良预后因素,与文献报道一致,提示早期诊断的重要性,以避免进展至器官功能不全,减少治疗的相关并发症。我们观察到的EBV+T/NK-LPD侵袭性高,预后差,多伴有发热、肝脾大,实验室检查可见血细胞减少、肝功能损害、LDH、TNF-α、IL-6升高,EBV-DNA持续升高,骨髓细胞形态、流式细胞学及骨髓病理检查相结合可发现异常淋巴细胞、组织细胞及EBV组织内感染的证据。在缺少明确的病理诊断依据的情况下,上述临床表现及实验室检查相结合可能成为EBV+T/NK-LPD快速诊断的方法,从而使患者获得较早的治疗时机。参考文献1、Ohshima K, Kimura H,Yoshino T,el a1.Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder(LPD)in children and young adults:overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.Pathol Int,2008; 58(4):209-217.2、Cohen JI. 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非霍奇金淋巴瘤患者外周血Treg细胞及IL-6、TNF-α水平的研究张倩 张红宇* 钟凤鸾 张文丽 许蕾 孟庆祥北京大学深圳医院血液内科,广东深圳,518036*通信作者:张红宇,主任医师. 电话:(0755)83923333-6125.E-mail: zyiqu@163.com△ 2011深圳市科技计划项目,项目编号201102028摘要:目的:通过对非霍奇金淋巴瘤患者Treg细胞及IL-6,TNF-α在疾病不同阶段的水平的观察,探索这些免疫因素在非霍奇金淋巴瘤预后中的作用。方法:将我院诊治的87例NHL患者按临床预后分为无事件生存组、复发组、难治组,另设健康对照20例,动态观察Treg细胞及IL-6,TNF-α在疾病不同阶段的水平。结果:87例NHL患者中无事件生存组64例,复发组14例,难治组9例;初治时NHL患者外周血Treg细胞比例、IL-6、TNF-α显著升高(P<0.05);其中难治复发组在起病时的Treg及IL-6水平较无事件存活组更高(P<0.05),TNF-α水平无统计学差异。停止治疗时所有NHL患者外周血Treg、IL-6、TNF-α的水平与健康对照相比无显著差异;停止治疗后3月及6月时Treg、CD4+T淋巴细胞比例有升高趋势,复发组较无事件存活组出现IL-6、TNF-α升高,但上述改变均不具统计学意义。结论:Treg细胞可能在NHL发病及疾病进展中起到促进作用,监测IL-6及TNF-α的表达水平对早期判断难治病例和预测复发可能有重要的临床意义。关键词:非霍奇金淋巴瘤;调节性T淋巴细胞;白细胞介素-6;肿瘤坏死因子-αLevels of regulatory T cells and concentrations of interleukin-6 and tumor necrosis factor-αin peripheral blood of patients with non-Hodgkin’s lymphomaZHANG Qian,ZHANG Hong-Yu*,ZHONG Feng-Luan,ZHANG Wen-Li,XU Lei,MENG Qing-XiangDepartment of Hematology,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036,Guangdong Province,China*Corresponding Author: ZHANG Hong-Yu,Senior Physician. Tel:(0755)83923333-6125. E-mail:zyiqu@163.comAbstract:Objective:This study was purposed to investigate the levels of regulatory T cells(Treg) and concentrations of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in peripheral blood of patients with non-Hodgkin’s lymphoma(NHL) and to explore their roles in the pathogenesis and prognosis. Methods: Eighty-seven patients with NHL were divided into three groups: events-free survival group, relapse group and refractory group ,the healthy controle group was set up as well. The levels of Treg cells and concentrations of IL-6 and TNF-α in peripheral blood of patients were analyzed during different periods. Results: There were 64 cases in the even-free groups, 14 cases in the relapse group and 9 cases in the refractory group.The levels of Treg cells and concentrations of IL-6 were significantly higher in all NHL patients, especially in relapse and refractory groups, while no difference were seen when compared with the concentrations of TNF-α.At the end of chemotherapy, the levels of Treg cells and concentrations of IL-6 and TNF-α had no difference with the healthy control group. More Treg cells and higher concentrations of IL-6 and TNF-α were seen in relapse group than event-free group at the time of 3 months or 6 months off treatment, but the difference was not statistically significant. Conclusions:Treg cells may play a key role in pathogenesis and development of NHL. IL-6 and TNF-α may become useful factors for predictor of relapse and refractory. Key words: non-Hodgkin’s lymphoma; Treg cell; IL-6; TNF-α非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)是免疫细胞在免疫应答过程中的恶性转化,除了瘤细胞本身的基因突变获得恶性转化外,现有研究也提示宿主的免疫环境、慢性抗原刺激,与免疫辅助细胞的接触和大量炎症细胞因子的分泌也是恶性淋巴瘤发病的重要环节[1-3]。白细胞介素(interleukin-6,IL-6)在NHL患者中升高,并认为可能与不良预后有关[4];在NHL中也可以观察到调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)细胞及高分泌IL-17的CD4+辅助性T细胞(Th17)的失衡,而且在某些NHL类型中可能具有预后意义[5]。目前NHL的治疗以放、化疗为主,虽然造血干细胞移植及单克隆抗体的使用改善了部分侵袭性淋巴瘤的预后,但复发及难治NHL仍是淋巴瘤治疗的难题,已有报道免疫调节剂通过改善肿瘤微环境和抑制炎症因子的释放成功应用于复发难治NHL的治疗。我们分析了我院诊治的87例NHL患者,结合其临床预后,动态观察了Treg细胞及IL-6,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在疾病不同阶段的水平,以探索这些免疫因素异常对NHL预后的影响及免疫调节剂治疗难治淋巴瘤的可能性。1 病例和方法1.1 病例:2007年12月至2012年12月我院诊治的87例NHL患者,其中男50例,女37例,中位年龄41岁(17岁-80岁)。所有患者均经过病理学检查确诊,符合世界卫生组织(WHO)2001年淋巴瘤分类标准。临床资料收集从治疗前开始,按照治疗效果共分为3组:难治组、复发组和无事件存活组。另以同期无感染、肿瘤、自身免疫性疾病者20例为健康对照。1.2 治疗:除难治、复发患者外,所有患者均已完成治疗。1.3 观察指标:临床特征:Ann Arbor分期、B症状、ECOG评分、IPI评分、结外器官受累情况、乙型肝炎病史等;免疫功能指标:淋巴细胞亚群,辅助性T细胞Th1/Th2, 调节性T细胞Treg(CD4CD25highCD127low);炎症细胞因子:TNF-α、IL-6;影像学及其他指标:CT、PET-CT等。免疫功能指标、炎症因子于每次治疗后监测,结束治疗的患者每3月复查一次,结束治疗时间为获得完全缓解后至少3个以上疗程。疾病复发为终点事件。1.4 检测方法 外周血CD4+CD25highCD127low Treg百分率: 静脉采取血样2 mL EDTA抗凝血,采用流式细胞术检测CD4+CD25highCD127low占CD4+T细胞的百分率。测定管加人FITC标记的抗CD4和APC标记的CD25各20 uL、PE标记的CD127 20uL ,将标本充分混匀,分别加100uL EDTA抗凝血于试管中,震荡器上充分混匀,避光放置15 min;加入溶血素2 mL,充分震荡,避光放置10 min。1 500 r/min离心5 min弃上清,加人生理盐水2 mL震荡,1 500 r/min离心5 min弃上清,加入生理盐水500ul,充分震荡混匀,待测。用FAC·SComp调整仪器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3 的电压及补偿。用CELLQuest软件获取20 000个淋巴细胞进行分析。选取CD4细胞进行分析,分别以同型对照管调整marker的位置。在同等的实验条件下,用以分析测定CD4+CD25highCD127low占CD4+ T细胞的百分率。(流式细胞术结果示例见图1)1.5 疗效评估:按照NHL的NCCN指南中疗效判定标准,难治组为治疗后无法获得完全缓解(CR)、不能确定的完全缓解(CRu)或部分缓解(PR)的患者;复发组为治疗获得CR或PR后出现新的累及部位或原部位进展50%以上者;治疗后获得CR或PR,无进展的患者归为无事件存活组。87例患者中复发组14例,病理类型包括弥漫大B细胞淋巴瘤7例,套细胞淋巴瘤3例,Burkitt淋巴瘤2例,鼻NK/T细胞淋巴瘤1例,血管免疫母细胞淋巴瘤1例。复发时间为停止治疗后5月-23月,中位时间9月。难治组9例,分别为结外NK/T细胞淋巴瘤3例,外周T细胞淋巴瘤2例,肠病T细胞淋巴瘤1例,肝脾T细胞淋巴瘤1例,间变大细胞T细胞淋巴瘤1例,Burkitt淋巴瘤1例。无事件存活组64例,无进展时间为停止治疗后5月-82月,中位时间为34月。各组淋巴瘤类型详见表1,除无事件存活组鼻NK/T细胞淋巴瘤2例分别为I期和II期外,所以患者的临床分期均>=III期。表1.各组淋巴瘤类型分布无事件生存组(64例)复发组(14例)难治组(9例)弥漫大B细胞淋巴瘤467-套细胞淋巴瘤43-Burkitt淋巴瘤421结外NK/T细胞淋巴瘤3(鼻)1(鼻)3血管免疫母细胞淋巴瘤11-外周T细胞淋巴瘤3-2肠病T细胞淋巴瘤--1肝脾T细胞淋巴瘤--1间变大细胞T细胞淋巴瘤3-11.6 随访:所有病例采用门诊随访或电话随访,随访截止日期2013年3月31日。中位随访时间24月(3月- 82月)。1.7 统计学处理:采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的数据采用X±SD表示,两组间的比较采用Student t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 NHL患者起病时淋巴细胞亚群、Treg细胞及IL-6,TNF-α NHL患者在起病时淋巴细胞亚群分析与健康对照相比,NHL初治患者CD8+T淋巴细胞及NK细胞比例显著升高(36.2±9.2% vs 22.3±7.4%,P<0.05;21.1±10.0% vs 11.7±6.3%,P<0.05)。外周血Treg细胞占CD4+T淋巴细胞比例7.9±2.9%,对照组5.9±1.6% ( P=0.0001) 。IL-6、TNF-α也较健康对照组有显著升高(8.9±3.4 pg/ml VS 1.3±0.7 pg/ml,P<0.05;33.7±10.3pg/ml VS 9.5±5.2pg/ml,P<0.05)。2.2 难治复发组与无事件存活组在淋巴细胞亚群、Treg及IL-6、TNF-α水平的比较 难治复发组在起病时的Treg及IL-6水平较无事件存活组更高(P<0.05),CD8+T淋巴细胞及NK细胞比例、TNF-α水平两组相比无统计学差异。(见表2)表2. 难治复发组与无事件存活组在Treg及IL-6、TNF-α水平的比较无事件生存组复发组(P值)难治组(P值)病例数(例)64149Treg(%)4.9±1.411.6±3.2(P<0.05)13.6±4.1(P<0.05)IL-6(pg/ml)3.6±1.27.8±3.1(P<0.05)8.1±0.9(P<0.05)TNF-α(pg/ml)25.1±11.337.9±10.8(P>0.05)42.9±9.6(P>0.05)2.3 结束治疗后各时间点(停止治疗后3月、6月)复发组及无事件存活组在免疫指标及细胞因子水平的比较停止治疗时NHL患者(包括无事件存活组及复发组)外周血Treg、IL-6、TNF-α的水平与健康对照相比无显著差异;停止治疗后3月及6月时Treg、CD4+T淋巴细胞比例有升高趋势,但无统计学意义;复发组较无事件存活组在停止治疗3月和6月时出现IL-6、TNF-α升高,但改变不具统计学意义。上述复发患者在停止治疗后的观察点上仍处缓解状态,由于停止治疗12月后复发的患者数量仅为4例,其它时间点的数据未列入统计范围。(表3)表3. 停止治疗后3月、6月复发组及无事件存活组在Treg及IL-6、TNF-α水平的比较Treg(%)IL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)停治疗后时间0月3月6月0月3月6月0月3月6月复发组5.8±1.66.8±0.48.7±2.51.5±0.42.7±1.15.2±2.88.5±4.49.3±3.89.8±2.5无事件存活组5.4±2.15.0±1.64.2±1.61.5±0.71.9±1.11.5±0.99.2±4.110.4±4.78.9±3.7图1: 左图为淋巴细胞比例,选取CD4+淋巴细胞进行分析;右图中P4为CD4+淋巴细胞中+CD25highCD127low细胞数3 讨论免疫环境的平衡与肿瘤的发生、发展密切相关。已有多项研究支持宿主的免疫缺陷和慢性炎症性疾病诱发NHL的发病,NHL无论是瘤内微环境还是外周血浆均有免疫细胞异常及炎症因子的高表达[1,3,6]。本研究初步观察了Treg细胞和TNF和IL-6在非霍奇金淋巴瘤外周血的表达水平。Treg细胞在维持自身免疫耐受及免疫稳态中起重要作用;NHL的外周血及肿瘤内均可发现Treg细胞增多,在B细胞NHL、ATLL、皮肤T淋巴瘤中Treg细胞增多[7-9]。有研究发现在B细胞NHL中Treg细胞在促进早期淋巴瘤进展的免疫逃避机制中起主要作用,但在后期NHL中没有观察到上述作用。目前也认为淋巴瘤细胞自分泌IL-2、IL-6等炎症因子,促进Treg细胞发育,本身具有降低宿主免疫反应促进肿瘤生长的作用。此外在B细胞NHL的活检标本内可以发现TH17细胞显著减少,提示B淋巴瘤细胞可通过影响了Treg细胞和TH17细胞间的平衡促进了肿瘤微环境的形成[10]。此外Treg/Th17失衡也可促进炎症因子的释放进一步促使NHL的发病。Th17细胞在IL-6、TGF-β同时存在的情况下,经由SATA-3通路活化特异性转录因子孤儿核受体(ROR- t),诱导初治CD4+ T细胞分化而成,分泌IL-17、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α 等多种细胞因子,促进炎症状态[11-12]。本研究没有动态检测TH-17细胞,但本次研究观察发现NHL起病时外周血中Treg显著升高(P<0.05),难治复发组更明显,随着病情的改善Treg下降,提示在NHL发病及疾病进展中Treg细胞可能起到促进作用。有研究证实化疗前高水平的IL-6是疾病难治的独立预后因素;Niistu.N在侵袭性NHL的研究中表明IL-6和血管内皮生长因子(VEGF)是侵袭性淋巴瘤的独立预后因素[4];在双胞胎人群中HL患者及健康同胞的IL-6及其基因型测定,具有低IL-6水平的基因型者患HL的风险降低[13]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)不仅参与肿瘤的修复,同时参与肿瘤的启动和增殖,也是淋巴瘤细胞自分泌细胞因子,是淋巴瘤细胞的强烈增殖信号。我们比较了难治复发组及无事件组免疫细胞及炎症因子的水平,发现难治复发组具有更高的IL-6及TNF-α,治疗过程中炎症因子未能显著减少者提示疾病难治,复发组在停止治疗后3月及6月时有IL-6升高的趋势(P>0.05)。NHL结束治疗后IL-6及TNF-α不能持续维持在正常水平或平衡状态可能与NHL疾病状态的复发相关。提示监测IL-6及TNF-α的表达水平对临床早期判断难治病例和预测复发有重要的临床意义。由于我们病种的限制,本研究中观察的病例大部分为B细胞淋巴瘤,尤以弥漫大B细胞淋巴瘤为主,虽然疾病分期几乎均>=3期,但未进一步细分至各淋巴瘤类型及不同IPI评分进行比较,所以可能对观察结果造成一定程度的偏倚,尚需要累积更多的病例后分组观察。但我们的研究仍观察到NHL患者起病时具有Treg、IL-6升高的特点,这些免疫因素的异常在NHL的病程中可能起到部分促进作用,在化疗过程中或治疗后由于宿主的免疫缺陷和炎症细胞因子的持续存在,可使肿瘤表现难治和复发。免疫调节剂沙利度胺成功地改善多发性髓瘤和复发难治套细胞淋巴瘤的预后,其机制可能包括沙利度胺可通过抑制NF-κB激活通路减少炎症细胞因子的释放并间接提高NK细胞和细胞毒T细胞的活性[14-15];抑制Treg细胞的生长,从而达到增加对化疗的敏感性并减少疾病复发的可能性。我们对上述免疫因素的临床观察支持免疫调节剂可通过改善宿主的免疫环境和炎症细胞因子浓度而有可能改善部分复发难治淋巴瘤的预后,值得进一步研究。参考文献[1] Lyons SF, Liebowitz DN. 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患者:左腋窝经典霍奇金淋巴瘤,检查结果为结节硬化型:ck(-)EMA(-)cp20(+)cD79a,AIK(-).cD30(+).cD15(-),cD21(-),IcA(-),cD21(-),bc1—6(-),Ki—67(50百分比) 有什么好的治疗方案, 以及化疗放疗后,该注意什么北京大学深圳医院血液内科张红宇:按你说的情况,病人应属早期霍奇金淋巴瘤,但需找淋巴瘤专科医生严格分期,同时了解有无不良预后因素(7项),早期霍奇金淋巴瘤无不良预后因素ABVD化疗2-4个疗程联合受累部位放疗,早期霍奇金淋巴瘤伴不良预后因素ABVD化疗至少4个疗程联合受累部位放疗,中期需有PET评价。
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