呼吸与危重症医学科

牟向东、李若瑜、万喆、王广发、柳平、王仁贵、何冰作者单位：100034北京，北京大学第一医院呼吸内科（牟向东、王广发、何冰），皮肤性病科、真菌和真菌病研究中心（李若瑜、万喆），病理科（柳平），影像科（王仁贵）肺隐球菌病（pulmonary cryptococcosis，PC）是由新生隐球菌感染引起的急性、亚急性或慢性肺部真菌感染[1]，临床表现无特异性，很难和细菌性肺炎、肺结核和肺部肿瘤等疾病相鉴别，非常容易误诊[2]。在国外，动物实验[3]和临床研究[4]均已证实：血清乳胶凝集试验（latex agglutination test，LA）检测隐球菌荚膜多糖抗原对肺部隐球菌感染具有很高的诊断价值，敏感性和特异性达93-100%，但国内没有相关的研究报告。我们应用血清乳胶凝集试验和肺活检组织病理检查进行临床对照试验，以探讨乳胶凝集试验对肺隐球菌病诊断的临床意义。对象与方法一、对象2000年7月至2007年7月北京大学第一医院住院患者共27例，均非获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者，根据临床表现和影像学特点，疑诊为肺部隐球菌感染。其中男性14例，女性13例，年龄在20～70岁之间，平均为49岁。二、方法27例患者全部进行血清乳胶凝集试验和肺活检组织病理检查，并分析肺隐球菌患者的临床表现和影像学特点，对其进行治疗和随访。1.仪器和试剂：（1）美国Immuno-Mycologics有限公司生产的隐球菌抗原乳胶检测系统；（2）水冲或隔热设备（56℃）；（3）100 rpm旋转仪器；（4）木制涂棒；（5）12×75mm非硅酸盐试管；（6）5ml无抗凝采血管。2. 血标本采集：常规操作方法收集全血无菌无抗凝管静脉血约4ml（室温下允许收集管中血样凝集10min），1000×g角转速离心15min，小心吸取血清溶液加入无菌容器密封，在-20℃冰冻保存待检。3.隐球菌抗原乳胶凝集试验[4]：（1）在50 ul链霉蛋白酶部分中加入300 ul血清并用封口膜密闭管口；（2）56℃孵育血清/链霉蛋白酶溶液30 min；（3）加入1滴链霉蛋白酶抑制液终止反应；（4）在环状薄片的分离环中分别加入25 ul隐球菌抗原阳性对照，阴性对照和经链霉蛋白酶处理的血清样本；（5）每个环中加入25 ul隐球菌乳胶；（6）利用分离的涂药棒彻底混合环中物质；（7）室温下100 rpm旋转仪器5 min；（8）在无光背景中立即读取结果。4. 肺组织活检[5]：采用CT或B超引导下经皮肺穿刺活检。肺组织标本应用4%甲醛液固定，石蜡包埋，组织切片，分别行HE染色、PAS染色和抗酸染色。实验结果1. 肺组织病理检查：肺隐球菌病患者9例，HE染色显示肉芽肿性病变（图1），PAS染色可发现染色阳性的隐球菌病原体（图2）。非隐球菌病患者18例，其中肺结核6例，3例抗酸染色阳性，另外3例可见干酪样坏死；肺部恶性肿瘤9例，其中肺腺癌5例（包括细支气管肺泡癌2例），小细胞肺癌1例，原发性肺淋巴瘤1例，肺转移癌2例；结节病1例；闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎（BOOP）2例。2. 肺隐球菌病的临床表现：其中3例患者无临床症状，均为体检胸片发现肺部阴影，病史超过3个月，为慢性感染，其中1人为脑梗塞，1人经常洗桑拿浴；5例患者有临床症状，如发热、咳嗽、咳痰、胸痛等，病史3周至3个月之间，为亚急性感染，其中1人为早孕，1人为2型糖尿病；最后1例为急性重症肺炎，伴有进行性加重的呼吸困难和Ⅰ型呼吸衰竭。患者因“斑秃”口服强的松20mg/d和甲氨蝶呤7.5mg/w共2年，饲养鹦鹉3年。所有患者均无脑膜炎症状。3. 肺隐球菌病的影像学特点：无症状患者多表现为孤立性或多发性结节状阴影，可伴有晕征，病灶相对稳定；有症状患者表现为多发斑片状浸润影或实变影，周围伴有明显的晕征，病灶往往有融合变大（图3）；急性重症患者表现为双肺浸润影，很快进展为大叶性实变（图4）。所有患者的肺部病灶多位于肺野外带，实变病灶可见支气管气相和空泡征，无坏死空洞形成。胸痛者病灶往往累及胸膜。4. 血清乳胶凝集试验结果：经病理证实的肺隐球菌病9例，乳胶凝集试验全部阳性；非隐球菌感染患者18例，乳胶凝集试验全部阴性。乳胶凝集试验的敏感性和特异性均为100%。因为大部分患者就诊的时间相对较晚，或院外误诊的时间较长，大部分在病程的第1-4个月检测，最早的在病程第8天，3例在肺穿刺前已临床诊断。3例行脑脊液（CSF）乳胶凝集试验，1例阳性，CSF压力明显升高，经两性霉素B治疗后2周后乳胶凝集试验转阴，压力恢复正常。5例患者同时检测曲霉菌抗原（半乳糖甘露聚糖，GM试验），4例阴性，1例为高滴度阳性，I = 6.54（＜1.5）。临床表现为重症肺炎，肺活检病理为肺隐球菌病，无曲霉菌感染，肺组织培养为隐球菌纯培养。治疗的1周后GM试验转阴，乳胶凝集试验持续阳性。2例检测1，3-β-D葡聚糖（G试验），均为阴性。5. 肺隐球菌病的治疗和随访[6]：除1例急性重症患者应用两性霉素B治疗以外，其余患者均应用氟康唑400 mg/d治疗3-9个月，均临床治愈。4例患者进行了监测，乳胶凝集试验阳性持续时间分别为2个月、5个月、6个月和12个月，肺部病灶消失的时间分别为1个月、4个月、5个月和10个月。急性或亚急性患者病灶吸收相对较快（1-4个月），慢性患者病灶吸收很慢（6-12个月）。也有1例肺内病灶长期不吸收者，乳胶凝集试验持续阳性。讨 论自然界中的新生隐球菌广泛存在于土壤及禽粪中，没有荚膜，易形成气溶胶，可经呼吸道吸入到达肺泡，引起肺隐球菌病（pulmonary cryptococcosis，PC）。在人体组织内的隐球菌则形成一层厚厚的荚膜，不易气溶胶化，因此本病从未发现人和人之间的传播。根据其荚膜抗原性的不同，新生隐球菌有A、B、C、D 4个血清型[7]，在我国临床分离的菌株约70 %属A型，B型和D型各占15 %和5 %，无C型[8]。肺隐球菌病临床症状无特异性，大部分患者无症状或仅有轻微的呼吸道症状，少数免疫功能受损患者表现为重症肺炎[9]。而痰涂片、痰培养和血培养的隐球菌检出率极低，支气管镜检查阳性率也不到10 %[2]。由于影像学表现为单发或多发性结节状阴影，临床极易误诊为原发性肺癌、肺转移癌、肺结核和肺炎等其他疾病[2,10-11]。乳胶凝集试验（latex agglutination test，LA）是以高效价的抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶上，从而检测血清或CSF标本中的隐球菌荚膜抗原[4]。血清型不同，能够检测到的最低值也不同。我院采用的试剂能检测到血清型A、B、C、D 抗原的低限分别为0.5 ng/ml、0.5 ng/ml、25 ng/ml 和0.5 ng/ml。国外的研究显示血清乳胶凝集试验对肺隐球菌病的敏感性和特异性达93-100%[3-4]。以前由于受血清中类风湿因子（rheumatoid factor，RA）的影响，可能会导致假阳性反应[12-13]。现在我们应用链霉蛋白酶预处理标本，可以消除RA[14]和其它免疫复合物[15]的影响，减少干扰反应[16]，提高实验的敏感性和特异性。本组的研究发现：经病理证实的肺隐球菌病9例，乳胶凝集试验全部阳性，非隐球菌感染患者18例，全部阴性。乳胶凝集试验的敏感性和特异性均为100%。有作者认为血清乳胶凝集试验阳性，提示隐球菌感染出现血行播散[9]，但是也有作者持相反的观点[17]。本组病例血清乳胶凝集试验全部阳性，但只有1例重症患者感染累及脑膜，其它均未发现感染播散的证据。乳胶凝集试验可以用来监测病情和估计预后[18]。通常在疾病的进展期，抗原的滴度会增高，而经有效治疗后，抗原的滴度会下降；治疗不彻底及复发者通常伴有连续几次标本滴度不变或升高。在成功治愈后，多数患者阳性反应仍将持续6个月。可能是因为死亡的新生隐球菌在CSF中清除缓慢，继续释放荚膜抗原的缘故[19-20]。当抗原滴度用来监测疗效时，必须使用同一厂商提供的试剂盒。我们对部分病例进行了监测，大部分在肺内病灶消失后1-3个月，乳胶凝集试验转为阴性。如果患者肺内的病灶持续不吸收，血清乳胶凝集试验将持续阳性。肺隐球菌患者血清乳胶凝集试验的滴度，可能和肺内病灶的体积以及其内病原体的数量有关。肺隐球菌病治疗的目标是消除症状，防止复发，肺内病灶逐渐吸收或稳定，而不必等待肺内病灶完全吸收和乳胶凝集试验转阴[6]。CSF乳胶凝集试验对诊断隐球菌脑膜炎具有更高的敏感性和特异性[21]。CSF墨汁染色镜检、培养或乳胶凝集试验中的任何一项阳性，均可诊断为隐球菌脑膜炎[6]。本组患者中3例进行了CSF检测，其中1例重症患者的CSF乳胶凝集试验阳性，同时伴有CSF压力升高。经两性霉素B治疗后2周后CSF恢复正常。美国感染疾病学会（IDSA）指南推荐所有隐球菌感染患者均要进行CSF检测，以决定治疗原则[6]。但也有作者认为免疫功能正常、无或轻微症状的肺隐球菌患者，可以不进行CSF检查[17,22]。本组病例的部分患者还检测了1，3-β-D葡聚糖（G试验）和半乳糖甘露聚糖（GM试验）。2例G试验全部为阴性。因为新型隐球菌细胞壁中含有的1，3-β-D葡聚糖较念珠菌和曲霉菌少，另外在其外面包裹了一层厚厚的荚膜，很难将1，3-β-D葡聚糖释放到血液中，所以G试验为阴性[23]。5例中GM试验，4例阴性，1例呈高滴度阳性，治疗1周后转阴。这是因为新型隐球菌荚膜抗原和曲霉菌半乳糖甘露聚糖具有交叉抗原性，当血中出现高滴度隐球菌荚膜抗原的时候，GM试验可出现阳性。但是曲霉菌感染不会导致乳胶凝集试验阳性。因此，当二者均为阳性时往往提示为新型隐球菌的严重感染而非二者的混合感染[24]。当然，肺隐球菌病的最终确诊还要依靠组织病理学。肺隐球菌病灶一般位于肺野外带，行CT或B超引导下经皮肺穿刺安全可行[25]。但对于重症患者，早期可能没有形成可供穿刺的肺部病灶，也可能无法耐受肺穿刺，导致临床诊断困难。此时，血清乳胶凝集试验作为一种早期无创的诊断方法，具有很大的优势。并且还可作为一种筛查和监测方法，为临床的诊断和治疗提供帮助。结论乳胶凝集试验检测血清隐球菌荚膜多糖抗原对肺部隐球菌感染具有很高的诊断价值。血清乳胶凝集试验阳性，结合临床和典型的影像学表现，可以临床诊断肺隐球菌病。血清乳胶凝集试验和经皮肺穿刺相结合的方法，使肺隐球菌病的诊断变得十分完善。

肺毛霉菌病（pulmonary mucormycosis）是由真菌界接合菌亚门毛霉目中的某些致病性真菌引起的严重肺部感染，又被称为肺接合菌病（pulmonary zygomycosis），是一种发病急、进展快、病死率高的肺部真菌感染，临床较为罕见，诊断和治疗极为困难[1]。毛霉菌病分为5种：肺脏型、鼻脑型、胃肠型、皮肤型、混合型及播散型，其中肺毛霉菌病最为常见。1 病原学和流行病学接合菌亚门中多种真菌都能引起本病，致病的是各个“属”中的“种”，这些种名目繁多，临床不易区分，统称为接合菌或毛霉菌。毛霉菌在自然界中无处不在，主要分布于土壤及腐败的食物中，生长迅速，易形成大量孢子，进入呼吸道。毛霉菌的毒力很弱，机体对其有很强的免疫力，因此毛霉菌病发病率很低。高糖及酸性环境有利于毛霉菌的生长繁殖，因此糖尿病酸中毒患者吸入毛霉孢子很容易进展为肺毛霉菌病。另外，随着艾滋病、恶性肿瘤等疾病的增加、激素和各种免疫抑制药物的应用以及器官移植的开展，该病的发病率也明显增加[2]。2 病理学浸润、血栓形成和坏死是毛霉菌病的特征性改变。毛霉菌的侵袭性很强，对动脉血管具有特殊的亲和力。一旦真菌孢子在感染部位生长，它们的菌丝就会迅速向周围组织扩散，并且容易侵犯血管，形成血栓，导致远端组织缺血、缺氧、酸中毒以及梗死，有利于真菌的进一步扩散，并形成恶性循环。镜下显示病变呈急性炎症过程，组织严重坏死、化脓，病变区域内可见大量菌丝，极少见到肉芽肿，这是本病的特征性改变。有时菌丝周围没有任何炎症改变。毛霉菌的菌丝粗细不均，直径7～25μm，分支成直角形，宽大无分隔或很少分隔，壁薄，某些地方菌丝塌陷，菌丝断面颇似孢子[1]。3 临床和影像学表现肺毛霉菌病的症状无特异性，一般急性或亚急性起病，病情通常比较严重。临床表现有发热、咳嗽、咯血、胸痛和呼吸困难等。临床及实验室检查无特异性，多数患者外周血WBC计数升高。最为常见的影像学表现为进行性、均质性肺叶或肺段的实变，也可表现为单个或多发性肺结节或肿块，上叶病变多见，其次为下叶[3]；超过40%的病例出现空洞，空气半月征较曲霉菌肺炎少见，一旦出现提示患者有可能出现大咯血，但预后却相对良好[4]；毛霉菌具有极强的组织穿透能力，常侵蚀肺小动脉，形成肺动脉栓塞、肺梗死、肺动脉瘤及假性血管瘤，病变进展迅速，如不治疗，多数死于大咯血[3]。肺毛霉菌病也可出现肺不张、胸腔积液和纵隔淋巴结肿大。3 诊断毛霉菌感染只有通过真菌病原学和组织病理学才能明确诊断。近年开展的真菌抗原检测如G试验、GM试验等在毛霉菌感染时均为阴性；痰液、针吸液及支气管肺泡灌洗液培养阳性率小于5%，血培养的阳性率更低；确诊主要依靠组织病理学[4]。以前因肺毛霉菌病进展快、病死率高，确诊主要依靠尸体解剖。目前诊断肺毛霉菌病最主要的方法是纤维支气管镜活检[5]，40%以上的病例，特别是糖尿病患者可见气管内病变：如气道狭窄梗阻、黏膜红肿溃疡或者有黏液性、脓性或凝胶状分泌物等[5]。菌丝特点见第2节所述，4 治疗一旦确诊为肺毛霉菌病，立即开始静脉应用两性霉素B 1～1.3 mg/kg，疗程至少8～10周，总量2～3 g，可与5-氟胞嘧啶联合应用；如果不能耐受，可应用两性霉素B脂质体3～5 mg/kg，其他抗真菌药物大多无效[5]。如果明确出现胸腔内感染，可应用两性霉素B胸腔内注射。另有报道新型口服唑类抗真菌药物博沙康唑对毛霉菌有效[6]。其他治疗包括高压氧、细胞因子以及铁鳌合剂等，目前疗效尚不明确[2]。由于毛霉菌极易阻塞局部血管和支气管，药物很难在病灶部位达到较高的浓度，单纯的内科治疗效果并不理想。两性霉素B应用2周症状无改善者，应早期进行手术干预，切除病灶。还有人认为肺毛霉菌病是一种外科急症，一旦确诊，应立即手术治疗[7]。5 预后该病的预后与基础病密切相关[4]，恶性血液病、粒细胞缺乏的患者肺毛霉菌病进展快，预后差，大多数在7 d内死亡，即使经过积极的治疗措施，病死率仍高达75%；而糖尿病患者合并肺毛霉菌病则症状相对较轻，预后好，病死率小于12%，其原因可能因为糖尿病作为基础病较恶性血液病更容易得到控制[5]。预后和治疗密切相关：如不治疗，死亡率几乎为100%；单独的药物治疗，病死率高达50%；而药物联合外科治疗，可使病死率降至11%[8]。

肺曲霉菌病（pulmonary aspergillosis）是由曲霉菌（Aspergillus）感染或者是吸入曲霉菌抗原所引起的一组急、慢性肺部疾病，包括过敏型、寄生型和侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）三种，反映了不同的宿主免疫状态[1]。IPA是其中最严重的类型，诊断和治疗均极为困难。1 病原学曲霉菌属于真菌界半知菌亚门的丛梗孢科，有18个群132个种，至少有20个种可以引起人类感染，如烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉等。其中烟曲霉最常见，可引起90%的感染。肺是最常见的原发感染灶，中枢神经系统其次，其它感染部位还有：皮肤、鼻窦、咽、消化道、肝脾等[2]。曲霉菌仅以菌丝形式生长，其菌丝有分隔，直径2-5μm，呈45°分叉，具有组织侵袭能力。2 流行病学和危险因素曲霉菌在自然界广泛分布于有机质坏死物、发霉的谷物、饲料、水、土壤和空气中。其感染缺乏区域性，但呈一定的季节性。一般秋冬阴雨季节多发，但骨髓移植患者在夏季常见。肺曲霉菌主要是外源性感染，绝大多数是经呼吸道吸入了大量的曲霉菌孢子所致，极少数为外伤性接种引起。医院感染是一个重要的因素，特别是医院邻近建筑工地或使用曲霉污染的空调系统，可造成医院内小范围内的暴发流行。曲霉菌为条件致病菌，当免疫功能受到抑制或损伤时易于受到感染。1996年欧洲一项大样本的尸检显示，IPA的发生率在过去的12年中增加了近14倍。常见的易患因素包括：骨髓移植、恶性血液病、实体器官移植、AIDS等[3]。中性粒细胞减少是最重要的危险因素。COPD作为IPA的一个易患因素受到越来越多的关注，主要见于使用大量激素及多种广谱抗生素治疗的患者。3 分型和临床表现肺曲霉菌病临床可分为[4]：①非致病性腐生菌寄殖（non-pathogenic saprophytic colonisation）；②肺曲霉菌球（aspergilloma）；③变态反应介导的肺曲菌病，包括曲菌性哮喘、变应性支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）、外源性过敏性肺泡炎；④侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）。ABPA表现为喘息、血嗜酸细胞和曲霉菌特异IgE升高，是机体对曲霉抗原发生的超敏反应；曲霉球是寄生曲霉菌病的典型表现，通常出现在免疫功能正常的个体； IPA的临床症状主要表现为持续性发热，咳嗽、胸痛等，严重时出现呼吸困难。发热很常见，并且常常发生在广谱抗生素治疗的同时，此外，发热也常常被激素的应用所掩盖。曲菌菌丝容易侵犯血管，形成局部的栓塞和出血，引起咯血。IPA是中性粒细胞缺乏者常见的咯血原因。胸腔积液不常见。4 影像学特征IPA的胸片表现包括：单发或多发结节、段或亚段实变、弥漫毛玻璃影（经常进展为实变）以及空洞。但25% IPA患者的胸片可正常。HRCT对IPA的诊断有较大帮助。结节是IPA最常见的CT表现。菌丝浸润血管可形成栓塞和出血带，表现为结节周围的毛玻璃影，称为“晕征”（halo sign），是IPA的早期特异表现[5]。肺组织坏死、收缩，可在一个肺部结节周围形成半月形气影，称为“空气半月征”（crescent air sign），较“晕征”出现得晚。晕征联合空气半月征对诊断IPA的敏感性>80%[6]。但这些征象并非IPA特有，也可见于毛霉菌、假丝酵母菌感染及BOOP、Kaposi肉瘤等。对怀疑IPA的患者应常规进行HRCT检查。5 诊断IPA采用分级诊断，共3个层次[1]：1）确诊（proven）：组织病理发现特征性菌丝伴/不伴来自相同部位的组织培养阳性；2）临床诊断（probable）：指临床表现符合，并且有2次痰培养或1次BAL培养或1次刷片培养阳性，或者1次BAL中找到特征性菌丝，或者血清或BAL中曲霉菌抗原检测阳性；3）拟诊（possible）：临床表现符合，但没有任何真菌学证据。2002年对侵袭性真菌感染诊断的国际共识再次强调：曲霉菌培养的敏感性差，因此确诊的“金标准”为组织病理阳性发现，不一定需要培养来证实。专家组推荐使用曲霉菌抗原半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）检测作为一个临床诊断依据，由于存在一定假阳性，故需要>1次检测结果为阳性[7]。6 治疗 对于免疫缺陷的患者，IPA往往是致命的。当临床怀疑IPA时应及时开始经验性抗真菌治疗，治疗效果取决于能否早期诊断、播散程度、抗真菌治疗力度和宿主免疫状态。多烯类、三唑类，棘球白素类为公认的抗曲霉菌药物[8]。传统的治疗为两性霉素B（或脂质体），但目前通常选用伊曲康唑，危重患者亦可选用伏立康唑和卡泊芬净，必要时联合2种抗真菌药物。在患者中性粒细胞恢复的过程中肺内病变暂时性增多时，不应该被误认为抗真菌治疗的失败。抗真菌疗程应到临床和影像学改变消失，培养转阴，潜在的疾病得到控制。