·基础研究·不同频率脉冲电磁场诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究 宋晋刚 许建中 周强 罗飞 李洪鹏【摘 要】 目的 探讨脉冲电磁场( PEMF)诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的适合频率。方法 选用场强1. 1 mT,频率分别为5, 25, 50, 75, 100和150 Hz的PEMF作用于MSCs,每日30 min,连续作用21 d,光镜下观察细胞形态变化,电镜下观察细胞超微结构,酶化学法和放免技术检测细胞的碱性磷酸酶(ALP)含量和骨钙素(OC)表达情况。结果 不同频率PEMF作用组均能诱导MSCs向成骨细胞分化;从 5~50 Hz频段, PEMF的成骨诱导作用随着频率的增加而增强;从50~150 Hz频段, PEMF的成骨诱导作用随着频率的增加而减弱。结论 频率是PEMF诱导MSCs成骨分化的重要影响因素之一, 50 Hz可能为诱导 MSCs体外成骨分化的适合频率。【关键词】 骨组织工程; 脉冲电磁场; 间充质干细胞; 分化; 频率 An exper imen ta l study on induc ing human mesenchyma l stem cells in to osteobla sts by d ifferen t frequenc ies of pulsed electromagnetic f ields SONG J in2gang, XU J ian2zhong, ZHOU Q iang, LUO Fei, L I Hong2peng. Departm ent of O rthopedics, South2W est Hospital, the 3 rd M ilitary University, Chongqing 400038, China 【Abstract】 Objective To study the suitable frequency of pulsed electromagnetic fields ( PEMF) for indu2 cing human mesenchymal stem cells (MSCs) differentiation. Methods The third generation of humanmesenchymal stem cells were irradiated by different frequencies of PEMF of 5, 25, 50, 75, 100, 150Hz, 1. 1mT, for 30min /d for 21 days. Morphological changes of the MSCs were observed under phase contrast microscope. The activity of Alkaline phosphatase (ALP) and the exp ression of osteocalcin (OC) were measured by enzymology and radioimmunitymeth2 ods to evaluateMSCs differentiation. Results Different frequencies of PEMF emp loyed in this study showed differ2 ent effects in inducingMSCs into osteoblasts. The differentiation ofMSCswas increasingwhen the frequency of PEMF was increased gradually from 5Hz to 50Hz, and then decreasing when the frequency of PEMF was increased from 50Hz to 150Hz. Conclusion Frequency of PEMF was one of the most important factors in inducingMSCs differen2 tiation. This study indicated that 50Hzwas the suitable frequency of PEMF for inducingMSCs into osteoblast in vitro. 【Key words】 Bone tissue engineering; Pulsed electromagnetic fields; Mesenchymal stem cells; Differ2 entiation; Frequency 骨组织工程是利用组织工程的原理与技术来促进骨细胞的增殖与分化,生成活体骨组织,可用于骨缺损的修复和再生,有望解决临床修复大范围骨缺损的难题[ 1 ] 。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是目前广泛用于构建组织工程骨的种子细胞, 经体外扩增后,常规采用化学诱导的方法使其向成骨细胞分化,与支架材料形成复合物,进而构建组织工程骨。有研究表明,脉冲电磁场( pulsed electromagnetic fields, PEMF)可促进成骨细胞的增殖分化、生长因子的分泌、细胞外基质的合成,启动骨的重建,加速骨的发育,促进骨的形成等[ 2, 3 ] 。因此,研究PEMF对MSCs 的成骨诱导作用对于构建组织工程骨有重要意义。本实验通过研究不同频率的PEMF对MSCs体外成骨分化的影响,以期找出其成骨诱导的适合频率,为新型生物反应器的研制以及进一步研究PEMF促进MSCs增殖分化的机制提供实验依据。材料和方法一、主要试剂与仪器主要试剂有: Percoll液( Sigma, 美国) 、1 ∶1 的 DMEM /F12 (Hyclone,美国) 、胎牛血清(Hyclone,美国) 、ALP检测试剂盒(南京建成生物研究所) 、骨钙素放免试剂盒(北京中国原子能研究院) 。主要仪器有: UV751GD 紫外/可见分光光度计(上海仪器总厂) 、可调试脉冲电磁作用仪(解放军后勤工程学院) 。 ·134· 中华物理医学与康复杂志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 二、方法 1. MSCs的分离与培养无菌抽取20 ~30 岁健康志愿者两侧髂骨骨髓 5~10 ml,肝素抗凝。将采集到的骨髓用1. 073 g/ml Percoll液分离,以5 ×105 / cm2 的密度接种于培养瓶内, 加含15%胎牛血清的DMEM /F12 培养液, 置 37℃、5% CO2 饱和湿度培养箱内常规培养。待细胞融合成单层并铺满瓶底80%后,以0. 25%胰蛋白酶消化,按1 ∶3 传代,用含10%胎牛血清的培养液继续培养。 2. 不同频率PEMF的作用取第3代MSCs消化离心,吹打制成细胞悬液,分为对照组与PEMF作用组。PEMF作用组又根据频率不同分为5, 25, 50, 75, 100和150 Hz作用组。每组以 1 ×104 / cm2 的密度接种于12 孔培养板中, 同时以 5. 0 ×105 /ml的浓度接种于50 ml培养瓶中, 每瓶 2 ml。将不同频率的PEMF 作用组置于PEMF 的 Helmho Iz线圈中,两线圈呈对偶式,间距10 cm,经霍尔效应测磁仪测得场强均匀性及稳定性良好。通过引线将线圈置于培养箱中,设定场强为1. 1 mT,频率分别为5, 25, 50, 75, 100和150 Hz,作用时间每日30 min, 连续作用21 d。对照组细胞置于同等条件下的培养箱中,不加PEMF作用。三、观测指标 1. 形态学观察每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况,并于传代培养的第1, 3, 5, 7, 14和21天拍照记录。 2. 超微结构观察 MSCs经PEMF作用,细胞铺满瓶底约80%时消化离心,用PBS洗涤2次, 2. 5%戊二醛固定,不同浓度的丙酮依次脱水,环氧树脂包埋,行常规超薄切片,以醋酸双氧铀2构橡酸铅双染色,在透射电镜下观察不同频率的PEMF作用组和对照组细胞的超微结构。 3. 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase,ALP)活性测定分别于脉冲电磁场作用的第3, 6, 9, 12和15天, 取出各组12孔培养板,消化离心,收集细胞, PBS洗涤 2次,调整细胞浓度至1 ×105 /ml,加入0. 5% Triton2 X100, 4℃冰箱中放置12 h。采用超声破碎细胞使其完全裂解。取50 μl细胞裂解液,按试剂盒操作说明依次加入试剂,用分光光度计在520 nm波长处检测其吸光度(A)值,计算ALP活性,并绘制成曲线。 4. 骨钙素(osteocalcin,OC)检测分别于实验的第7, 14和21天,取出各组50 ml培养瓶,经胰酶消化后,取1 ×106 个细胞,离心后加入 1 ml PBS与Trito2X100,按1∶1混合, 4℃冰箱中过夜, 粉碎,送西南医院核医学科,采用放免法测定细胞内 OC的含量。根据放射免疫竞争结合原理,放射性标记物125 I 2骨钙素和样品中所含骨钙素与有限量的骨钙素抗体竞争性结合,γ计数器可测定沉淀物cpm (每分钟计数,放射性物质量的单位) ,以标准曲线计算样品 OC的含量。 5. 钙结节染色 MSCs经PEMF作用,待培养板中出现圆形或卵圆形结节后,取出盖玻片,用PBS洗涤3 次, 75%酒精固定30 min,将固定后的细胞玻片置于茜素红染液中染色5~10 min, 1%醋酸溶液快速冲洗,不同浓度的乙醇依次脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,摄像记录。四、统计学分析应用SPSS 11. 0统计软件,采用单因素方差分析、 F检验进行统计学分析。组间数据采用Tukey法进行多重比较, P < 0. 05为差异有统计学意义。结 果一、倒置相差显微镜观察第3代细胞接种后4 h完成贴壁, 24 h后贴壁细胞开始分裂增殖。经PEMF连续作用5 d的MSCs较对照组密度高、体积大,呈三角形、多角形或鳞形,胞浆中含有较多的基质成分和颗粒状物质(图1, 2) 。不同频率的PEMF作用组间细胞形态无明显差别。随培养时间的延长,细胞逐渐汇合成铺路石状,进而出现重叠生长,基质堆积, 3周后基质矿盐沉积并融合成圆形或卵圆形的钙化结节,结节周围的细胞呈放射状分布 (图3) 。二、超微结构观察透射电镜下观察到经PEMF作用的MSCs较为成熟,核浆比例小,胞质内有丰富的细胞器,如线粒体、粗面内质网、高尔基体等(图4 ) ; 而对照组的 MSCs较为幼稚,细胞核较大,核浆比例大,细胞器较少(图5) 。图1 对照组MSCs传代培养第5天显微镜下观( ×100) 中华物理医学与康复杂志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 ·135·三、ALP活性检测将各组MSCs ALP活性绘制成曲线,可见PEMF 作用第3天,不同频率的PEMF作用组MSCs的ALP 活性即较对照组增强,且随着作用时间的延长,ALP活性增强更为明显,于第12天达高峰,第15天时基本稳定,但仍明显高于对照组水平( P < 0. 05) ;不同频率的 PEMF作用组的MSCsALP活性不一, 50 Hz作用组明显高于其它频率作用组( P < 0. 05,图6) 。图6 各组MSCsALP活性曲线注:不同频率的PEMF作用组与对照组相应时间点比较, P < 0. 05; 50 Hz作用组与其它频率作用组相应时间点比较, P < 0. 05四、OC定量检测 FEMEs作用第7 天, 不同频率的PEMF 作用组 MSCs的OC 开始出现少量表达, 对照组无表达; 第 14天,不同频率的PEMF作用组MSCs的OC含量增高,而对照组仍无表达;第21天,对照组OC出现少量表达,不同频率的PEMF作用组MSCs的OC含量明显高于对照组( P < 0. 01) 。PEMF作用频率不同,细胞 OC含量不一, 50 Hz作用组OC含量明显高于其它频率作用组( P < 0. 05,表1) 。表1 不同频率PEMF作用MSCs的OC含量测定 ( ng/ml, x- ±s) 组 别 OC含量 7 d 14 d 21 d 对照组0 0 0. 99 ±0. 13# PEMF作用组 5 Hz作用组0. 62 ±0. 12 1. 24 ±0. 16 6. 16 ±0. 22 3 # 25 Hz作用组0. 65 ±0. 13 1. 43 ±0. 23 8. 01 ±0. 28 3 # 50 Hz作用组0. 73 ±0. 12 1. 62 ±0. 24 14. 80 ±0. 25 3 75 Hz作用组0. 72 ±0. 14 1. 48 ±0. 15 11. 36 ±0. 23 3 # 100 Hz作用组0. 71 ±0. 08 1. 30 ±0. 13 6. 21 ±0. 22 3 # 150 Hz作用组0. 61 ±0. 07 1. 18 ±0. 16 5. 25 ±0. 25 3 # 注:与对照组比较, 3 P < 0. 01;与50 Hz作用组比较, # P < 0. 05 五、茜素红钙结节染色 MSCs经PEMF作用21 d后,基质矿盐沉积并融合成圆形或卵圆形的钙化结节,结节周围的细胞呈放射状分布,茜素红钙结节染色呈阳性,可见橘红色钙结节。对照组钙结节染色呈阴性。讨 论 构建理想的组织工程骨,首先要有生物学特性较佳的种子细胞。间充质干细胞来源于中胚层,属于成体干细胞,具有很强的增殖能力和多向分化潜能[ 4 ] , 是目前常用的种子细胞,其成骨分化作用受细胞因子、激素、物理因子等多种因素的影响。 ·136· 中华物理医学与康复杂志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 PEMF作为一种非侵入性疗法在骨折延迟愈合及骨不连的治疗中均取得了满意疗效,现在已经被用于治疗先天性骨缺损、骨坏死、骨移植及脊柱椎体融合术后等骨科疾病。研究表明, PEMF能广泛地介导细胞外基质的合成,增强成骨细胞ALP的表达,促进OC及胶原的合成与分泌[ 5 ] ,而MSCs又是骨修复过程中形成成骨细胞的重要始祖细胞之一, 因此我们推测 PEMF能够对MSCs产生类似的生物学效应,并促进成骨。这一推论在本实验室的前期工作中已得到了证实[ 6, 7 ] 。在电磁场的各项参数中,频率对电磁场所产生的生物学效应有较大的影响。有研究认为,电磁场产生生物学效应的频率范围大约在1~100 Hz[ 8 ] 。骨骼系统的内生性活动频率范围在步态频率( 1~5 Hz)到肌肉收缩的动力频率(10~100 Hz)间变化。Lee等[ 9 ]认为,最有效的电磁场频率范围应接近机体正常功能活动频率。我们参考Bassett 等[ 10 ] 关于不同参数的 PEMF对骨折愈合影响的报道及相关文献, 在1 ~ 150 Hz频率范围间选择5, 25, 50, 75, 100和150 Hz频段,研究不同频率PEMF作用对MSCs向成骨细胞分化的作用,以期找出诱导MSCs成骨分化的适合频率。本研究结果显示,倒置相差显微镜下观察到经 PEMF作用的MSCs体积明显较对照组大,呈三角形、多角形或鳞形,细胞内颗粒状物质增多,基质分泌旺盛。透射电镜观察到,经PEMF作用的MSCs较为成熟,分化程度较高;而对照组的MSCs较为幼稚,分化程度低。3周后形成圆形或卵圆形的矿化小结,经茜素红染色为阳性。ALP是成骨细胞的早期标志酶,在成骨过程中水解磷酸酯,为羟基磷灰石的沉积提供必要的磷酸,有利于成骨,可标志成骨分化的开始[ 11 ] ; OC是成骨细胞特异性合成和分泌的一种非胶原蛋白, 在钙离子存在的条件下,与羟磷灰石结合并稳定其构象,是向成骨细胞分化的最具特征性的标志物[ 12 ] 。因此,ALP和OC是反映成骨细胞在体外分化为成熟骨细胞及基质钙化的两个重要指标[ 13 ] 。本研究同时发现,不同频率的PEMF作用组细胞第3日即可检测到 ALP的表达,并随着时间延长,表达水平逐渐增高,提示细胞的成骨分化已经开始; 1周后出现OC的表达, 3 周后达到较高水平,与矿化小结出现的时间相一致。而对照组ALP活性始终很低, OC几乎没有表达。这证明MSCs经PEMF作用后,可向成骨细胞分化。不同频率的PEMF作用组间比较发现, PEMF诱导MSCs 成骨分化的效果与作用频率有关:从5~50 Hz频段, 随着频率的增加,其成骨诱导作用逐渐增强;从50~ 150 Hz频段,随着频率的增加,其成骨诱导作用逐渐减弱。我们推测,频率是PEMF成骨诱导的重要影响因素之一, PEMF的作用频率不同,对细胞的成骨诱导作用不一, 50 Hz可能为诱导体外MSCs向成骨细胞分化的适合频率。关于不同频率的PEMF促进MSCs成骨的生物学机制,还有待日后进一步深入探讨。参 考 文 献 1 Robert F. Tissue engineers build new bone. Science, 2000, 289: 14982 1500. 2 方真华,吴华,马伟明. 50Hz电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响. 中华物理医学与康复杂志, 2004, 26: 124. 3 Diniz P, Shomura K, Soejima K. Effects of pulsed electromagnetic field ( PEMF) stimulation on bone tissue like formation are dependent on the maturation stages of the osteoblasts. Bioelectromagnetics, 2002, 23: 3982 405. 4 PittengerMF,Mackay AM, Beck SC, et a1. Multilineage potential of a2 dult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, 284: 1432147. 5 Lohmann CH, Schwartz Z, Liu Y, et al. Pulsed electromagnetic field stimulation ofMG63 osteoblast2like cells affects differentiation and local factor p roduction. J 0 rthop Res, 2000, 18: 6372646. 6 赵敏,许建中,周强. 脉冲电磁场促进人骨髓间充质干细胞成骨的研究. 中国矫形外科, 2004, 12: 4392443.7 赵敏, 许建中, 周强, 等. 脉冲电磁场诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究. 中华物理医学与康复杂志, 2005, 27: 528. 8 Muehsam DJ, Pilla AA. The sensitivity of cells and tissues to exogenous fields: effects of target system initial state. Bioelectrochem Bioenerg, 1999, 48: 35242. 9 Lee JH, Mcleod KJ. Morphologic responses of osteoblast2like cells in monolayer culture to ELF electromagnetic fields. Bioelectromagnetics, 2000, 21: 1292136. 10 Bassett CA,ValdesMG, Herandez E. Modification of fracture repairwith selected pulsing electromagnetic fields. J Bone Joint Surg, 1982, 64: 8822892. 11 Aubin JE,Liu F,Malaval L, et al. Osteoblast and chondroblast differen2 tiation. Bone, 1995, 17: 77283. 12 LevyMM, Joyner CJ,VirdiAS, et al. Osteop rogenitor cells ofmature hu2 man skeletalmuscle tissue: an in vitro study. Bone, 2001, 29: 3172322. 13 Owen TA, AronowM, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: recip rocal relationship s in exp ression of genes associated with osteoblast p roliferation and differentiation during formation of the bone extracellularmatrix. J Cell Phsiol, 1990, 143: 4202 430. (修回日期: 2005201220) (本文编辑:吴 倩) 中华物理医学与康复杂志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 ·137·
中国矫形外科杂志 2004年12月第12卷第23、24期 Orthop J Chin , Vol. 12 ,No. 23、24 December 2004 ·1867 ··实验研究·宋晋刚 许建中 周 强 罗 飞 李洪鹏摘 要 目的: 探求脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 促进人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells , hMHCs) 增殖的适合频率。方法: 选用场强1. 1 mT, 频率分别为5、25、50、75、100、150Hz 的PEMF 刺激hMSCs , 30min/ d , 光镜观察细胞形态, MTT法和流式细胞技术检测细胞增殖水平及生长周期。结果: 各频率组PEMF刺激均能促进MSCs 增殖; 频率不同, 促增殖的效应不一, 其中50Hz 频段效果最为显著, 生长曲线比对照组明显前移, S 期细胞百分比(28. 89 ±0. 25) %较对照组(13. 57 ±0. 55) %增高107 %。结论: 频率是PEMF 促进hMSCs 增殖的重要影响因素之一, 50Hz 为促进hMSCs 增殖的适合频率。关键词 脉冲电磁场; 间充质干细胞; 频率; 增殖中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005 - 8478 (2004) 23、24 - 1867 - 03Effect of pulsed electromagnetic fields on accelerating human mesenchymal stem cells proliferation by different frequency∥SONG Jin2gang , XU Jian2zhong , ZHOU Qiang , et al . Department of Orthopaedics , Southwest Hospital , the Third Military Medical University , Chongqing400038Abstract Objective :To research the suitable frequency of pulsed electromagnetic fields (PEMF) on human mesenchymal stem cells (hMSCs)proliferation. Method :The third generation hMSCs were irradiated by different frequency PEMF of 5 ,25 ,50 ,75 ,100 ,150Hz , 1. 1 mT,30min/ d. The method of MTTwas employed to evaluate the level of proliferation. The parameter regarding the variation of the cell cycle was detected with the flow cytometry(FCM) . Result : Different effect on accelerating MSCs proliferation by different frequency PEMF. The significant effect was at the frequency of 50Hz. The percentage of cells at the S phase (28. 89 ±0. 25) was increased 107 % compared with that of the control group (13. 57 ±0. 55) . Conclusion :Frequency is one of the most important factor on accelerating MSCs proliferation ,and 50Hz is the suitable frequency of PEMF accelerating MSCs proliferation in vitro.Key words Pulsed electromagnetic fields (PEMF) ; Mesenchymal stem cells (MSCs) ; Frequency ; Proliferation△基金资助:国家高技术研究发展计划(863) 重大专项《组织工程技术修复长骨缺损及人工皮肤的研发》(2003AA205020) ;重庆市科技攻关项目《组织工程骨与软骨优化制备及应用研究》(2003 - 13 - 6) ; 西南医院创新基金:人MSCs 体外快速扩增及诱导分化修复骨缺损的临床研究(2002 - 15)作者单位:第三军医大学西南医院骨科, 重庆市 400038作者简介:宋晋刚(19762) ,男,四川省绵阳人,医师,硕士在读。研究方向:骨组织工程和脊柱外科。电话: (023) 65398052 E2mail :sjgfelix@163. net 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell , MSCs) 作为一种成体干细胞, 具有极大的可塑性及多向化潜能, 是体外构建组织工程骨常用的种子细胞。目前种子细胞的体外扩增需要3 周左右时间, 如何使种子细胞快速、优质扩增是构建组织工程骨所面临的紧要问题。 本实验旨在研究不同频率段脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 刺激对体外MSCs 增殖的作用, 以期找出促进MSCs 增殖的适合频率范围, 为应用PEMFs 促进MSCs快速扩增, 研制新型生物反应器以及进一步研究PEMFs 促进MSCs 增殖的机制提供实验依据。1 材料与方法1. 1 主要试剂与仪器Percoll 分离液(Sigma 公司, 美国) , DMEM/ F12 (1∶1) 培养基(Hyclone 公司, 美国) , 优质胎牛血清(Hyclone 公司,美国) , 四甲基偶氮唑蓝(MTT) (Sigma 公司, 美国) , 酶联反应检测仪(DG3022A 型, 华东电子管厂) , 流式细胞仪(Becton Dickinson , 美国) , 可调试脉冲电磁刺激仪(由解放军后勤工程学院陈俊斌教授提供)1. 2 方法1. 2. 1 hMSCs 的分离与培养 无菌抽取20~30 岁健康志愿者两侧髂骨骨髓5~10ml ,肝素抗凝。用1. 073 g/ ml Percoll 液梯度离心, 以5 ×105/ cm2个细胞接种于培养瓶, 加含15 %胎牛血清的DMEM/ F12 培养液, 置37 ℃, 5 %CO2 饱和湿度培养箱内培养。待原代细胞铺满瓶底80 % , 以0. 25 %胰蛋白酶消化, 按1∶3 传代, 用含10 %胎牛血清的培养液继续培养。1. 2. 2 不同频率PEMF 刺激hMSCs 取第三代hMSCs 消化离心, 吹打制悬, 分为对照组和不同频率PEMF 刺激组, 每组以1 ×104/ Cm2 接种于50ml 培养瓶及以5 ×103/ ml , 200ul/ 孔接种于96 孔培养板中。将刺激组置于PEMFs 的HelmhIz 线圈中, 两线圈呈对偶式, 间距10cm ,经霍尔效应测磁仪测得场强均匀性及稳定性良好。通过引线将线圈置于培养箱中, 设定场强1. 1 mT, 频率分别为5、25、50、75、100、150Hz , 刺激时间30min/ d。对照组细胞置于同等条件下的培养箱内, 不加PEMFs 刺激。1. 2. 3 MTT法检测细胞活性及生长曲线 每天PEMFs 刺激结束后, 取各组96 孔板, 每孔加入5mg/ ml MTT溶液20μl , 继续培养4h 后吸弃孔内上清液, 加入二甲亚砜(DMSO) 150μl/ 孔, 电动振荡仪震动10min 使沉淀充分溶解后, 选择490nm波长, 每板设一不含细胞的调零孔,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收OD 值。以时间为横轴, 光吸收OD 值为纵轴绘制细胞生长曲线。1. 2. 4 流式细胞仪检测细胞周期 刺激组与对照组培养瓶细胞接种后第5d , 细胞融合近80 % , 消化离心, 各组待测细胞用PBS 洗涤2 次, 迅速注入预冷的75 %乙醇, 振荡混匀以1 ×106 个细胞密度悬浮固定细胞, 4 ℃过夜。经荧光染料染色后, 流式细胞仪488nm波长检测, 获得DNA 含量分布组方图和细胞凋亡比例。以增殖指数(proliferation index , PI) 分析PEMFs 对MSCs 分裂增殖水平的影响, 同时进行DNA 倍体分析。PI = [ (S + G2/M) / ( GO/G1 + S + G2/M) ] ×100 %。1. 2. 5 统计学分析 应用SPSS 11. 0 统计软件, 采用单因素方差分析, F 检验对数据进行统计学处理。各频率组间数据采用Tukey 法进行多重比较, P < 0. 05 认为差异具有显著性意义。2 结 果2. 1 形态学观察 倒置相差显微镜逐日观察hMSCs 生长情况和形态特征。传代细胞于接种后4h 完成贴壁, 24h 后贴壁细胞开始分裂增殖, 部分区域形成细胞集落, 细胞呈均匀一致的长梭形外观。3d 后经PEMFs 刺激的hMSCs 形态比对照组大, 数目校对照组多, 排列更为紧密; 各频率刺激组间细胞形态无明显差别, 数目有所不一, 以50Hz 刺激组细胞密度最大。2. 2 对hMSCs 增殖水平的影响 经细胞增殖与活性的MTT 检测, 各刺激组与对照组OD值绘制成生长曲线如图1。由图中可见, PEMFs 刺激后的hM2SCs 增殖能力比对照组增强, 刺激组生长曲线较对照组前移,并且峰值增高。刺激频率不同, 细胞增殖速度不一, 以50Hz刺激组明显快于其他频率刺激组( P < 0. 05 ) 。图1 不同频率PEMF 刺激MSCs 生长曲线(n = 12 , 各刺激组与对照组相比较, P < 0. 05 )2. 3 对hMSCs 细胞周期的影响 经流式细胞仪检测, 各PEMFs 刺激组样本均未发现有DNA 倍体异常的细胞(diploid : 100 %) ; 各实验组细胞周期检测结果见表1。PEMF 刺激后的hMSCs 细胞周期发生了改变,S期细胞百分比较对照组增高; 刺激频率不同, 细胞周期改变不一, 其中50Hz 频段S 期细胞百分比(28. 89 ±0. 25) %较对照组(13. 57 ±0. 55 ) %增高107 %。各频率刺激组间作多重比较, 50Hz 频率显著高于其他频段组( P < 0. 05) 。这种改变与MTT方法测定的结果是相吻合的。表1 流式细胞仪检测不同频率PEMF 刺激后MSCs 细胞周期组 别G0 + G1 细胞周期( x ±s)SG2 +M PI 值对照组82. 93 ±0. 32 13. 57 ±0. 55 3. 5 ±0. 54 17. 075Hz 组70. 34 ±0. 25 21. 65 ±0. 26 8. 01 ±0. 32 29. 6625Hz 组69. 07 ±0. 26 26. 09 ±0. 30 4. 83 ±0. 28 30. 9250Hz 组63. 86 ±0. 45 28. 89 ±0. 25 8. 05 ±0. 63 36. 1675Hz 组65. 95 ±0. 30 26. 58 ±0. 45 7. 48 ±0. 50 34. 06100Hz 组72. 54 ±0. 56 21. 60 ±0. 63 5. 86 ±0. 42 27. 46150Hz 组74. 31 ±0. 72 20. 44 ±0. 60 5. 25 ±0. 45 25. 69 n = 5 ,各实验组与对照组相比较, P < 0. 053 讨 论 利用组织工程的原理与技术促进骨系细胞的增殖与分化, 生成活体骨组织用于骨缺损的修复和再生, 有望解决临床修复大范围骨缺损的难题。构建理想的组织工程骨首先要有生物学特性较佳的种子细胞。间充质干细胞来源于中胚层, 是目前常用的种子细胞, 虽然具有很强的自我复制能力, 但由于细胞数量少, 在骨髓中的密度低, 大约只有十万分之一, 采用常规的培养方法, 难以在短期获得大量优质的细胞来满足构建组织工程骨的需要。研究表明, 脉冲电磁场( pulsed electromagnetic fields ,PEMFs) 可启动骨的重建, 加速骨的发育; 促进成骨细胞的增殖、生长因子的分泌、细胞外基质的合成; 促进骨的形成和成熟等[1~3 ] 。MSCs 是骨修复过程中形成成骨细胞的重要始祖细胞之一, 因此我们推PEMFs 能够对MSCs 产生一系列生物学效应, 并促进成骨。这一推论在本实验室前期工作中得到了初步证实4 ,5 ] 。然而刺激的频率不同, 是否会对细胞增殖及细胞周期产生不同的影响? 在组织工程骨的构建中我们应该选择怎样的合适频率范围? 选择适当的参数对促进MSCs 的体外扩增及新型生物反应器的研制有重要意义。 频率对电磁场产生的生物学效应有较大影响。研究认为, 电磁场产生生物学效应的频率范围大约在1~100Hz[6 ] 。骨骼系统的内生性活动频率范围在步态频率(1~5Hz) 到肌肉收缩的动力频率(10~100Hz) 间变化, Lee 等[7 ] 认为最有效的电磁场频率范围应接近机体正常功能活动频率。我们参考Bassett 等[8 ]关于不同参数PEMF 对骨折愈合影响的报道及相关文献, 在1~150Hz 频率范围选择5、25、50、75、100、150Hz 频段, 研究不同频率PEMFs 刺激对MSCs 体外增殖的作, 以用期找出促进hMSCs 增殖的适合频率。 倒置相差显微镜观察发现, 经PEMF 刺激的MSCs 密度在细胞融合成单层之前明显较对照组高。MTT 法测定的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT 降解成蓝紫色的结晶并沉积细胞中, 而死细胞无此功能。利用流式细胞仪检测细胞周期, S 期细胞百分比升高, 表明细胞的DNA 合成速度增高, 细胞增殖加速。通过以上检测发现,PEMF 的生物学效应, 在细胞水平上, 表现为促进细胞的增殖; 在染色体DNA 水平上, 表现为对细胞周期的影响, 提高细胞的S 期百分比。5~150Hz 频率段PEMF 均能促进MSCs 体外增殖, 各频率刺激组间作多重比较, 发现50Hz 频段促增殖效应显著高于其他频段组( P < 0. 05 ) 。从5~50Hz , 随着频率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐渐增强; 从50~150Hz ,随着频率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐渐减弱。 实验表明, 频率是脉冲电磁场促进hMSCs 增殖的重要影响因素之一, 刺激频率不同, 促进细胞增殖的效应不一,50Hz 为刺激促进MSCs 增殖的适合频率。本实验为骨髓间充质干细胞体外快速扩增提供了新的思路和依据, 并为新型生物反应器的设计提供适合的频率参数。关于PEMFs 促进MSCs增殖的生物学机制, 我们将在以后的研究中进一步探讨。参考文献:[1 ] Lohmann CH , Schwartz Z, Liu Y, et al . 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sjgfelix@163.com 13990169502短篇论著椎体成形术治疗老年胸腰椎爆裂性骨折宋晋刚 苗 艳① 崔易坤* 尹振宇 黄海锋(四川省绵阳市中心医院脊柱外科,绵阳 621000)①(四川省绵阳市人民医院康复中心,绵阳 621000)*通讯作者,E-mial:sjgfelix@163.com[摘要] 目的 探讨经皮椎体成形术治疗老年骨质疏松引起的胸腰椎爆裂性骨折的临床效果。方法:2010年1月~2012年10月,对25例不伴有明显神经症状的胸腰椎爆裂性骨折的老年患者行经皮椎体成形手术治疗。术前结合体位复位,术中根据骨折特点个体化穿刺及注入骨水泥,有效固化椎体、恢复椎体高度、纠正后凸成角。术后1、6、12月随访疼痛视觉模拟评分(VAS)、伤椎高度恢复率、伤椎后凸Cobb角。 结果:所有患者术后即可获得椎体稳定,腰痛VAS评分较术前明显降低(2.5±0.9 vs. 9.2±0.8,P=0.000),椎体高度恢复(85.2%±4.4% vs. 80.3%±4.1%,P=0.000),后凸Cobb角减小(8.1o±2.1o vs. 11.4o±2.4o,P=0.000),23例获得随访,术后12个月疼痛VAS评分进一步降低,术后6、12个月椎体高度、后凸Cobb角无明显丢失。 结论:经皮椎体成形术可用于治疗老年骨质疏松爆裂性骨折,安全有效,但需要谨慎选择适应证及个体化制定手术方案。[关键词]:椎体成形术;骨质疏松;爆裂性骨折;骨水泥;微创Percutaneous vertebroplasty in treatment of osteoporotic thoracolumbar burst fractureSong Jingang, Miao Yan, Cui Yikun, et al.Mianyang Sicuan,621000,P.R.China;Department of Orthopaedics,Central Hospital of Mian Yang.Abstract: objective To explore the feasibility and clinical effect of percutaneous vertebroplasty in treatment of osteoporotic thoracolumbar burst fracture. Methods From January 2010 to October 2012, the 25 cases of osteoporotic thoracolumbar burst fracture without neurological sign were choosed. Position reset before operation, individualized puncture and injection of bone cement based on the characteristics of fracture in operation, effective cure vertebral body to restore vertebral body height and corrected convex Angle.Pain and disability were measured by visual analog scale (VAS), height of fractured vertebra and the Cobb′s angle on sagittal plane were measured by preoperation,postoperation and at the last follow up. Results 23 patients were followed up. The pain were disappear, VAS is significantly lower preoperatively (2.5±0.9 vs. 9.2±0.8, P=0.000). The height of the fracture vertebra (85.2%±4.4% vs. 80.3%±4.1%, P=0.000) and the Cobb′s angle (8.1o±2.1o vs. 11.4o±2.4o, P=0.000) were significant improved from preoperation (P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" following-up="" p="">0.05). No symptomatic complication was recorded in all patients. Conclusions Percutaneous vertebroplasty is an effective treatment of thoracolumbar burst fracture of osteoporotic, but need to choose the indication carefully and making the operation plan individual. Key words: Percutaneous vertebroplasty;Osteoporosis; Burst fracture ; Bone cement; minimally invasive经皮椎体成形术(percutaneous vertebroplasty,PVP)自20世纪90年代应用于临床,目前是治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的有效方法。老年骨质疏松引起的胸腰椎骨折大多为压缩性骨折,但也有不少为爆裂性骨折,这部分患者曾被许多文献视为PVP的禁忌证或相对禁忌证。我科自2006年开展PVP微创手术,2010年1月~2012年10月采用PVP治疗老年人胸腰椎爆裂性骨折25例,效果满意,现报道如下。1 临床资料与方法1.1 一般资料本组25例,男17例,女18例。年龄60~89岁,平均72岁。跌伤10例,车祸伤8例,提重物损伤7例。均有外伤后剧烈腰痛,腰部活动受限,伤椎棘突叩压痛明显。手术在伤后1周内完成。术前常规行胸腰段正侧位X线片、CT及MRI检查,了解骨折是否为新鲜骨折及椎体后壁是否完整、是否合并椎管狭窄。均为新鲜骨折(MRI脂肪抑制像呈高信号),骨折椎体T11 2例,T12 3例,L1 4例,L2 8例,L3 7例,L4 1例。椎体压缩程度10%~25%,后凸Cobb角8°~13°。椎体后壁完整,无椎管狭窄。骨密度T值2.5~3.5。入选标准:年龄>60岁;双能X线骨密度测定,参照骨质疏松诊断标准[1],骨密度T值>2.5;骨折为骨质疏松引起,排除椎体转移性肿瘤发生病理性骨折;骨折椎体CT检查,骨折类型为爆裂性骨折,椎管占位<20%,不伴有神经症状;MRI加脂肪抑制成像,MRI脂肪抑制像呈高信号,提示椎体骨折为新鲜骨折;骨折部位正侧位X线片检查,测量椎体高度,压缩<30%,后凸成角<15°。1.2 方法1.2.1 设备及器械 一次性椎体成形器械包(成都光大医疗器械有限公司),包括穿刺针、扩张套管、工作通道、扩髓钻等;骨水泥(聚甲基丙烯酸甲酯,PMMA,德国Heraeus Medical GMBH公司);数字减影设备(ALLURA-FD20,荷兰飞利浦公司)。1.2.2 手术方法 入院后平卧硬床,骨折部位加垫后仰辅助复位。术前肌注布桂嗪100 mg以减轻术中疼痛。俯卧过伸位,数字血管减影(digital substraction angiography,DSA)定位确定骨折椎体。常规消毒铺巾,2%利多卡因局部麻醉,尖椎开孔,穿刺针经伤椎上关节突下外缘进入椎弓根,根据生理角度调整倾角及夹角,沿椎弓根骨性通道进入椎体后壁。继续进针2~3 mm,抽出穿刺针内芯,置入导针,沿导针置入扩张套管和工作通道,经工作通道将扩髓钻缓慢钻入椎体骨质扩髓。工作通道要求置于椎体中前份,比单纯压缩性骨折位置靠前。经济条件许可的患者可加用球囊扩张,辅助塌陷的椎体复位并形成硬壳,减少骨水泥渗漏机率。将拉丝期骨水泥缓慢注入复张后的骨折椎体内,DSA术中监视,根据骨水泥分布控制推注速度,调整工作通道深度。如有较大的骨折碎块,可在注入骨水泥前用明胶海绵进行封堵,待骨水泥弥散满意后停止注入。全程监测患者生命体征。1.2.3 术后处理 术后平卧休息24小时,待穿刺点无渗血后戴腰围保护下床,防止跌倒。继续抗骨质疏松药物正规治疗,口服阿仑膦酸钠、骨化三醇、含维生素D2的钙片3~6个月。术后1、6、12个月定期随访,摄正侧位X线片,测量椎体前缘高度变化,对术前、术后椎体高度恢复率、脊柱后凸Cobb角、疼痛缓解程度及并发症进行评价。1.2.4 观察指标 ①疼痛程度:采用视觉模拟评分(visual analog score,VAS),0分为无痛,10分为剧痛。②伤椎高度恢复率:伤椎前缘高度与其上下正常椎体前缘高度和的平均值之比。③后凸Cobb角:侧位X线片上确定后凸与正常移行部椎体,上方在移行椎体上缘连线划垂线,下方在移行椎体下缘连线划垂线,两垂线的夹角。1.2.4 数据处理 采用SPSS11.0软件,计量资料采用x±s表示,采用One-way ANOVA检验,两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果25例均顺利完成手术,穿刺点出血5~10 ml。其中双侧穿刺3例,单侧穿刺22例。手术时间30~90 min,平均50 min。每个椎体注入骨水泥3.0~7.5 ml,平均6.0 ml。术中出现骨水泥渗漏6例,其中渗漏至椎间盘内2例,椎旁3例,椎旁静脉1例,均无明显临床症状。无椎管内渗漏。所有患者术后即可获得椎体稳定,腰痛VAS评分较术前明显降低,椎体高度恢复,后凸Cobb角减小,23例获得随访,术后12个月疼痛VAS评分进一步降低,术后6、12个月椎体高度、后凸Cobb角无明显丢失,见表1。2例术后短暂下肢神经症状(下肢放射性疼痛、麻木),直腿抬高试验阳性,经脱水及营养神经治疗1周后消失。术后X线及CT复查,伤椎外形及高度基本恢复正常,骨水泥填充满意,伤椎后缘骨块无椎管内移位。3 讨论经皮椎体成形术(percutaneous vertebroplasty,PVP)最早于20世纪80年代提出,能即刻稳定骨折、强化椎体、恢复脊柱序列、缓解疼痛、早期功能锻炼、减少并发症。与传统开放手术比较,具有创伤小(经皮穿刺,不损伤肌肉、血管、韧带等组织结构),对患者全身情况干扰小(局部麻醉,手术时间短,创伤小,对心肺功能影响小),效果显著(术后即刻缓解疼痛),恢复快(术后无须长期卧床,可以早期功能锻炼)等优点,被广泛用于治疗老年骨质疏松性椎体压缩性骨折。老年人胸腰椎爆裂性骨折被许多文献列为PVP的禁忌证或相对禁忌证[2]。这类患者大多有严重的骨质疏松,内固定手术可能出现拔钉或松动;患者由于高龄,大多合并慢性支气管炎、肺气肿、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心肺疾患,开放手术风险大,而如果选择保守治疗,不仅痛苦时间长,恢复慢,长期卧床还会使老年人面临更多危及生命的并发症如感染、深静脉血栓、脑卒中等。随着脊柱微创外科技术的迅速发展,椎弓根穿刺技术的提高,以前一些手术绝对禁忌证成为相对禁忌证。近年来,有学者采用PVP治疗骨质疏松性椎体爆裂骨折,取得较满意的疗效[3,4]。对老年爆裂性骨折病例的选择,我们在严格遵守PVP适应证的基础上要求:①年龄>60岁,<60岁者一般行内固定手术治疗。②采用双能X线骨密度测定,参照骨质疏松诊断标准,骨折为骨质疏松引起,排除椎体转移性肿瘤发生病理性骨折。③骨折椎体CT检查,骨折类型为爆裂性骨折,椎管占位<20%,不伴有神经症状。如椎管占位>20%,或伴有神经症状,PVP手术可能会加重椎管占位或加重神经症状。④MRI脂肪抑制像呈高信号提示椎体骨折为新鲜骨折。如为陈旧性骨折,不宜行PVP治疗。⑤术前测量骨折椎体高度,椎体压缩<30%,后凸成角<15°。如椎体压缩>30%、后凸成角>15°,PVP手术很难恢复椎体高度及正常的脊柱序列。如果椎体压缩>30%,可行球囊扩张椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty,PKP)治疗,能有效恢复椎体高度。⑥球囊位置要求置于椎体中前份,较单纯压缩性骨折靠前,以保证椎体后缘骨块在复位过程中不被向后挤压而加重椎管狭窄。入院后在完善检查期间采用平卧硬床,骨折部位加垫后仰,可以辅助复位。术前俯卧过伸位有助于爆裂的椎体后缘骨块在后纵韧带的作用下向椎管内回复。术中发现,通过体位复位,这类患者大多能明显减轻后凸成角,使压缩的椎体复张。术中注入高黏度骨水泥,通过膨胀固化,进一步恢复椎体形态及高度。术前肌注布桂嗪(强痛定)能有效减轻术中疼痛,弥补部分患者局麻止痛效果的不足,使患者能很好配合完成手术。本组均在局麻下完成,无术中改用全麻。相比较全麻而言,局麻对心肺功能干扰小很多,安全有效。对于这类患者,术前要仔细阅读X线片及CT,了解骨折线走行、椎体破裂部位及程度,设计手术进针的方向、角度及深度。术中穿刺使通道尽量靠近椎体终板完好的一端,保持较大的内倾角使穿刺针位于椎体中份,尽量选择椎弓根完整的一侧穿刺完成手术。对于穿刺困难、骨水泥弥散不佳的病例,可选择双侧椎弓根穿刺。如有较大破损,可先用明胶海绵经推杆置入填塞。由于骨折椎体破损多,调制骨水泥应该比单纯压缩性骨折较为黏稠,以降低渗漏率。在推注过程中,先缓慢注入少量骨水泥,待破损边缘骨水泥硬化形成硬壳保护后,再继续推入骨水泥。程喜红等[5]采用分次灌注法治疗椎体后壁破裂的骨质疏松性骨折。为保证骨水泥的良好分布,可将水泥推杆先置于椎体前方,根据术中影像,椎体前柱弥散满意后,后退推杆位置,使椎体中柱弥散填充。但不能将推杆退至工作通道后方,否则有引起椎管内渗漏的风险。本组术中骨水泥渗漏6例,其中渗漏至椎间盘内2例,椎旁3例,椎旁静脉1例,均无明显临床症状。这类患者的渗漏率较单纯压缩性骨折高,可能与爆裂性骨折椎体碎裂程度较重有关。骨水泥是否渗漏并不单纯取决于骨折类型,还取决于水泥推杆位置以及骨水泥注入时期、速度、量和压力等多种因素[6]。此外,椎体复位后可使后纵韧带紧张,从而阻止后壁骨块后移,也可以部分阻止骨水泥的渗漏。2例术后下肢疼痛、麻木,给予静注甲泼尼龙、甘露醇脱水及甲钴胺营养神经药物1周后消失,分析可能由于手术操作中骨块碎裂刺激神经根水肿所致。关于手术效果,我们进行了1年左右的随访,未发现严重并发症,疼痛缓解及椎体高度恢复率维持良好。骨质疏松是这类患者的基础病因,PVP手术只是解决骨折及疼痛问题,术后仍然需要正规的抗骨质疏松治疗,否则容易发生再骨折及相邻椎体骨折[7]。任炼等[8]对PVP术后进行了长达6年的随访,各指标基本维持稳定,结果证实,椎体成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折安全而有效,远期疗效肯定。通过以上分析,我们认为PVP可以用于治疗老年骨质疏松椎体爆裂性骨折,安全有效,临床效果良好。但需要操作者具有熟练的穿刺技术,术前谨慎选择适应证,根据骨折特点个体化制定手术方案。参考文献[1]中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.原发性骨质疏松症诊治指南(2011年).中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2011,4(1):2-17.[2] 刘建青,慕明章,杜 伟,等.经皮穿刺椎体成形术综合治疗老年人骨质疏松性椎体压缩骨折20例报告.中国微创外科杂志,2008,8(9):822-824.[3] Li CH,Chang MC,Liu CL,et al.Osteoporotic burst fracture with spinal canal compromise treated with percutaneous vertebroplasty.Clin Neuml Neurosurg,2010,112(8):678-681.[4] 干曼峰,杨惠林,丁 懿,等.椎体后凸成形术治疗骨质疏松性椎体爆裂骨折.中国骨与关节外科,2012,5(1):11-15.[5] 程喜红,唐利民,吴 琦,等.分次灌注增强椎体后壁破裂骨质疏松性椎体压缩骨折.中国骨质疏松杂志,2010,16(6):444-446.[6] 韩 为,张华山,吴小春,等.后凸成形术在脊柱爆裂性骨折中的应用.实用骨科杂志,2010,16(1):34-24.[7]宋晋刚,苗 艳,崔易坤,等.椎体成形术后相邻椎体骨折的临床研究.临床合理用药杂志,2012,5(9):21-23.[8] 任 炼,李志忠,隋 杰,等.骨水泥充填椎体成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折:6年随访.中国组织工程研究,2012,16(12):2110-2114.(收稿日期:2013-12-09)(修回日期:2014-04-15)(责任编辑:王惠群)